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1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤C•1．基因工程的正确操作步骤是()•①使目的基因与载体相结合•②将目的基因导入受体细胞•③验证目的基因的表达是否符合特定性状要求•④提取目的基因•A．③②④①B．②④①③•C．④①②③D．③④①②C一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P9第一和二两段化学合成法反（逆）转录法一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因如：cDNA文库提取某种生物的全部DNA限制酶一定大小的DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库P10基因组文库某种生物的单链mRNA单链cDNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶P10cDNA文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较P101.概念：3.原理：(二)利用PCR技术扩增目的基因4.前提：2.目的：6.过程：7.特点：阅读P10最后两段5.条件：1.PCR含义：P10以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）DNA复制（碱基互补配对原则）模板DNA、原料(四种脱氧核苷酸)、能量、酶（热稳定DNA聚合酶）、引物、温度指数2n有一段已知目的基因的核苷酸序列大量扩增目的基因5.条件：3.原理：2.目的：4.前提：7.过程：8.特点：(二)利用PCR技术扩增目的基因过程P10高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）PCR过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链PCR动画PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子2．下列属于PCR技术的条件的是（）①引物②目的基因所在的DNA片段③游离的4种脱氧核苷酸④游离的4种核糖核苷酸⑤DNA连接酶⑥DNA聚合酶⑦DNA限制性核酸内切酶A．①②③⑤B．①②③⑥C．①②③⑤⑦D．①②④⑤⑦B3．下列有关PCR技术的叙述正确的是A.作为模板的DNA序列必须不断的加进每一次的扩增当中B.作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断的加进每一次的扩增当中C.反应需要的DNA聚合酶必须不断的加进反应当中D.反应需要的DNA连接酶必须不断的加进反应当中B目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)逆转录酶合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因小结（二）、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1、从生物材料中直接提取2、人工合成反（逆）转录法根据蛋白质的氨基酸序列合成DNAD4.下列获取目的基因的方法中需要模板的是()•①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA•A．①②③④B．①②③•C．②③④D．②③D质粒目的基因限制酶DNA连接酶基因表达载体——重组DNA二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶构建过程构建目的（基因表达载体功能）？起初科学家把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:它们各自的作用是什么?1、目的基因2、启动子3、终止子4、标记基因5、复制原点基因表达载体的组成1.用_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建4.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止密码C.标记基因D.目的基因B5、目的基因与运载体结合所需的条件是()•①同一种限制酶②具有标记基因的质粒③RNA聚合酶④目的基因•⑤DNA连接酶⑥四种脱氧核苷酸⑦ATP•A.①②③④⑤⑥⑦B.①②④⑤⑥⑦C.①②③④⑤D.①②④⑤⑦D①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：限制酶和DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必须以表达载体的方式携带进去。小结三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射技术——Ca2+处理法（感受态细胞）目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②适用对象：双子叶植物、裸子植物③原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③过程：④优点P12（2）基因枪法——单子叶植物（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②受体细胞：受精卵③程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：Ca2+处理法Ca2+处理细胞细胞壁通透性增大感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步第二步第三步个体生物学水平鉴定四、目的基因的检测与鉴定转基因生物的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交技术是否显示出杂交带目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA）同上目的基因是否翻译出蛋白质抗原——抗体杂交同上包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同目的基因成功表达的标志：通过转录翻译合成蛋白质归纳步骤8.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（）A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D表达1.(08上海生物卷)以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。（1）获得目的基因的方法包括和。（2）切割和连接DNA分子所使用的酶分别是和。从生物材料中直接分离人工的方法合成限制酶DNA连接酶（3）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或，后者的形状呈。（4）由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率，所以在转化后通常需要进行操作（5）将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和序列上是相同的。氨基酸筛选低环状质粒2.转基因植物油是由转基因植物通过压榨或浸出法加工制得的，因其出油率高而被广泛采用。我国是植物油消费大国，每年都从国外进口大量的转基因植物油。(1)在培育转基因油料植物的过程中，基因操作需要的工具酶是__________________________。在基因表达载体中，目的基因的首端必须含有_________，它是_____________识别和结合位点。(2)请写出一种将目的基因导入油料植物细胞可以采用的方法：____________________________________。若受体细胞为植物体细胞，可采用______________技术获得转基因植物体，该技术所依据的原理是______________________。限制酶和DNA连接酶启动子RNA聚合酶农杆菌转化(或基因枪、花粉管通道)法植物组织培养植物细胞的全能性(3)若要检测(2)中获得的植物细胞染色体上是否含有目的基因，可采用________________技术。而想要得知上述植物是否真的出油率高，应如何做？________________________________________________________________________。DNA分子杂交将该植物制出的植物油与同等质量的非转基因植物制出的植物油称重比较3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）aa4．不属于获得目的基因的方法有（）A．构建基因文库从基因文库中获取B．人工合成C．PCR技术大量获得D．利用农杆菌转化法获得D知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子原核生物基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核生物基因结构真核生物基因结构编码区非编码区（同上）外显子：转录，能编码蛋白质的序列内含子：不转录，不能编码蛋白质的序列原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核生物基因结构