第二十章 药物的体外抗菌试验

第二十章药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验（antimicrobialtestinvitro）是在体外测定微生物对药物敏感程度的实验，已广泛地应用于科研、生产和临床。如：抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测定、药物含量的测定、药物浓度的测定、指导临床用药的药敏实验等。抗菌实验包括抑菌实验和杀菌实验。抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微生物，在药物除去后微生物又能生长；杀菌：即能杀死微生物，当药物除去后，微生物也不能再生长繁殖。两者并非绝对，只是在一定条件下相对而言。第一节常用的体外抑菌实验体外抑菌实验是最常用的抗菌实验，方法简便，需时短，用药量少，不需要动物和特殊设备，一般在玻璃器皿中进行。常用的方法有连续稀释法和琼脂扩散法。一、连续稀释法（serialdilutiontest））可用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。可以用液体培养基，也可用固体培养基。1、液体培养基连续稀释法在一系列试管中，将液体培养基按一定的倍数稀释药物，获得药物浓度递减的系列试管，然后在每一管中加入定量实验菌，经培养一定时间后，肉眼观察试管混浊情况，记录抑制实验菌生长的最低浓度（即MIC）。图20-1液体培养基连续稀释法2、固体培养基连续稀释法分平板法和斜面法。1）平板法可同时测定大批实验菌株的MIC，且不受药物颜色及混浊度的影响，适于中药制剂或评价新药的药效学（药物的体外抗菌活性测定）实验。将系列浓度的药物混入琼脂培养基，使制成一批药物浓度呈系列递减的平板。然后将含有一定细胞数的实验菌液（通常为104左右）以点接种法接种于平板上，可以逐个点种，也可采用多点接种器接种；同时设无药空白平板对照。培养后观察结果。2）斜面法是固体培养基上连续稀释法的一种，是将系列浓度的各药分别混入固体培养基中制成斜面，在斜面上接种一定量的实验菌，然后观察是否有菌生长，判断MIC值。二、琼脂扩散法（agardiffusiontest）是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作用强弱的原理设计而成，具有各种不同的方法。常用的有以下几种：1、滤纸片法琼脂扩散法中最常用方法适用于新药的初筛实验（初步判断药物是否与抗药作用）及临床的药敏实验（细菌对药物的敏感性实验，以便选择用药），可进行多种药物或一种药物不同浓度对同一种实验菌的抗菌实验。首先将实验菌均匀混入琼脂培养基，制成含菌平板，然后将一定大小的滤纸片蘸取药液置于平板上，培养后即可观察结果。根据抑菌圈直径的大小，评价药物抗菌作用的强弱。WHO于1981年曾推荐Kirby-Bauer法（k-B法）作为标准化的药敏实验。k-B法基本原理是滤纸片法，但需用统一的培养基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以及其他实验条件。结果判断以卡尺精确量取，根据抑菌圈的直径大小判断该菌对药物是抗药、中等敏感或敏感。2、打孔法2、打孔法在含琼脂平板上打孔，孔内加入药液，经培养后可产生一定大小的抑菌圈。适于药物血浓度的监测，血清用量少，敏感性高，操作简便。3、挖沟法先制备琼脂平板，在平板上挖沟，沟的两边垂直划线接种各种实验菌，再在沟内加入药液。培养后根据沟两边所生长的实验菌离沟的抑菌距离来判断对这些菌的抗菌效力。适用于在一个平板上实验一种药物对几种实验菌的抗菌作用。H:\其他--中药妇炎乐药敏实验结果第二节杀菌试验一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定杀菌实验用以评价药物对微生物的致死活性。最低杀菌浓度指该药物能杀死细菌的最低浓度。从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度（MLC）。一般是将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上图20-1，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）MBC（或MLC）的含义也可定义为在一定条件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少量微生物存活的药物最低浓度。据此进行实验时，在药物连续稀释后，每管内加入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培养后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养液0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌数，以使99.9%微生物致死的药物最低浓度为MLC，即在一定条件下，存活的菌数不多于原始接种数的0.1%.二、活菌计数法（viablecountingmethod）是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。活菌计数的方法：一般是取实验菌与药物作用后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基，倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。如果药物作用后，存活菌数很少，也可采用微孔滤膜过滤法测定。三、石炭酸系数测定法（phenolcoefficient）又称酚系数法，是以石炭酸为标准，在规定的实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。石炭酸系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。石炭酸系数=消毒剂的杀菌稀释度/石炭酸的杀菌稀释度石炭酸系数大于或等于2为合格。举例：将石炭酸准确稀释为1：90、1：100，、、等；待测消毒剂准确稀释1：150、1：170、、、。分别取上述稀释液各5ml（10ml）加入一系列无菌试管中，置于20℃恒温水浴，使反应保持在20℃以下进行。各管内再加入伤寒沙门菌培养液各0.5ml,立即开始准确计时,在加菌后5、10、15分钟，分别从管中取一接种环的混合液接种于一支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定时间后，观察并记录结果。+为有菌生长，-为无菌生长。表20-1石炭酸系数测定浓度作用时间51015石炭酸1:90---1:0+--1:10++-消毒剂1:150---1:170---1:200---1:225---1:250+--1:275++-根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准来计算，则石炭酸系数=250/100=2.5或根据三个相同杀菌结果的稀释度比值的平均值来计算,则:石炭酸系数=(225/90+250/100+275/110)/3=2.5石炭酸系数愈大,则被测消毒剂的效力愈高.但石炭酸系数的应用有一定局限性,因为某一消毒剂对伤寒沙门菌的石炭酸系数的大小并不能完全代表它对其他细菌作用的强弱.另外,石炭酸系数法还有以下缺点:1)有机物存在时消毒剂失去活性;2)消毒剂可能对组织有毒性;3)随温度变化而影响测定结果;4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给予正确评价.第三节联合抗菌试验在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液的相互影响。加强药物抗菌作用的为协同（synergism）；减弱药物作用的为拮抗（antagonism）；互相无影响的为无关（indifference）；作用二者之和为累加（addition）。联合抗菌试验的常用方法一、纸条试验（paperstriptest）即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。图20-2是纸条实验的示意图。图20-2是纸条实验的示意图。图中A列的两纸条中只有一条含有抗菌药物，另一条不含抗菌药物；B列的两纸条均含有抗菌药物。二、梯度平板纸条试验（paperstrip-gradientplatetest）需先制备含药的梯度平板。梯度平板的制备是先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再将平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养基。在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌药物，自高浓度（+）至低浓度（-）依次递减。要求其抑菌浓度的位置约处于平板的一半。将实验菌悬液涂布于平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如待检药液对平板的药物有加强作用，则可见纸条两端的抑菌区被扩大。图20-3纸条梯度平板试验三、棋盘格法（checkboardtest）是由于在试验时,含两种不同浓度药物的试管排列呈棋盘状而得名,用以评价两种药物同时用不同浓度进行联合试验时的抗菌活性。实验时排列6排试管，每排6管，共36管使成方块，A及B药各以液体培养基进行稀释，A药各稀释度纵行定量加入各管，B药各稀释定量按横排加入，两药同时作单独抗菌实验对照。然后加入定量菌液，经培养后观察结果。棋盘格法的结果用部分抑菌浓度（FIC）及FIC指数来评价。FIC：又称联合抑菌分数，指某一药在联合前后所测得的MIC比值。如二待测药为A、B，则FIC（A）=A药与B药联合试验时A药的MICA药单独试验时的MICFIC（B）=B药与A药联合试验时B药的MICB药单独试验时的MIC所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即FIC指数=FIC（A）+FIC（B）FIC指数小于1，两药有协同作用，即两药联合较单独实验的抑菌作用为强。FIC指数的值愈小，则联合抗菌作用愈强。如20-2如20-2FIC指数与联合抗菌效应FIC指数联合抗菌效应小于0.75协同1累加1-2无关大于2拮抗第四节体外抗菌试验的影响因素1、试验菌一般应用标准菌株。标准菌株来自专门的供应机构。我国由北京卫生部生物制品检定所菌种保藏中心供应。在特定条件下，有时需用临床新分离菌株。试验菌加以合理的保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征鉴定。2、培养基原料、成品的外观及性能应符合要求。3、抗菌药物药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制。固体药物应配制成溶液使用，有些不溶于水的药物需用少量有机溶剂或碱先行溶解，再稀释成合适浓度，如氯霉素及红霉素需用少量乙醇溶解。药液的PH值应尽量接近中性，使能保持药物的稳定性而又不致影响试验菌的生长。中药制剂中含有鞣酸，且具有特殊色泽，影响结果判断。4、对照实验1）试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。2）已知药物对照：已知的抗菌药物对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。3）溶剂及稀释液对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释液应无抗菌作用。