15抗生素类药物的分析

抗生素类药物的分析YangXin-JiContents概述1β-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析3、抗生素效价单位抗生素效价的标示量，原则上应按所含特定的抗菌活性部分的重量来计算。在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是按照各种抗生素的特点及使用经验，采用符合客观实际的效价单位表示。常用的抗生素效价单位有重量单位、类似重量单位、重量折算单位、特定单位。YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析（1）重量单位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯游离碱或游离酸）的重量1μg作为1单位，即1mg=1000单位。如链霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、土霉素；氯霉素、新生霉素酸、利福霉素SV等均以重量单位表示。用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只要单位一样或有效部分重量一样，则这一抗生素的各种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析（2）类似重量单位以特定的纯抗生素制品盐的重量1μg作为一个单位，即1mg＝1000单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内。如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。这种类似重量单位，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。（3）重量折算单位以特定的纯抗生素制品的某一重量为一个单位而加以折算。如青霉素国际标准品（1952年）青霉素G钠称重0.5998μg为1单位，即1mg=1670单位，则80万单位的青霉素G钠称重应为0.48g。YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析（4）特定单位以一特定量的抗生素标准品（或对照品）作为1单位。如第一批杆菌肽国际标准品（1953年）杆菌肽A为1mg=55单位。制霉菌素（1963年）为1mg=3000单位等。这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价也难以计算，只能以国际标准品的效价单位，作为比较的基准。目前，抗生素的剂量原则上以纯品的重量表示，并加注单位。如土霉素0.25g（250000单位）；但个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析4、抗生素微生物检定用标准品标准品是指与商品同质且纯度较高的抗生素，每1mg含有一定的活性单位，用作供试品效价测定时的标准。国际标准品是经过国际有关机构协议认定的每1mg含有一定单位的标准品。其单位称为国际单位。抗生素标准品效价单位的含义，世界各国应一致。抗生素的国际标准品是在联合国世界卫生组织生物检定专家委员会主持下，委托英国（伦敦）国立生物标准检定所负责（如标准品原料的挑选、理化分析、分装与分发等）。YangXin-Ji第一节抗生素类药物分析我国抗生素国家标准品就是按上述原则制订的。但是我国的特有品种则以理论上的纯品一定量定为1个单位，即为1μg，以某批精制纯品作为原始标准品，再去标定暂行标准品或国家标准品。我国药典和部颁标准所规定的抗生素效价检定用标准品，是由中国人民共和国卫生部主持，由中国药品生物制品检定所统一负责，与国内有关的药检所或药厂对原料进行选择，理化分析、协作标定效价单位、分装、稳定性考查、分发等工作。每批标准品都有有效期的规定。YangXin-Ji第一节概述1.抗生素（antibiotics）在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.分类β–内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星)四环素类(四环素、金霉素、土霉素)大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B)多肽类(多黏菌素、放线菌素)YangXin-Ji第一节概述3.来源生物合成（发酵）化学合成或半合成4.特点化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差YangXin-Ji第一节概述5.抗生素质量分析——生物学法、物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大理化方法：准确度与专属性较高,且操作简便；但与临床疗效有偏差YangXin-Ji第二节β–内酰胺类CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素(苄青霉素)(penicillins)CHCOHNNH2NSCH3CH3COOHO氨苄西林CHCOHNNH2HONSCH3CH3COOHO阿莫西林YangXin-Ji第二节β–内酰胺类CHCOHNNH2CH3NOSCOOH头孢氨苄CH3NOSCOOHCHCOHNNH2头孢拉定CH3NOSCOOHCHCOHNNH2HO头孢羟氨苄SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa头孢噻吩钠YangXin-Ji第二节β–内酰胺类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanicacid,简称6-APA青霉素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-aminocephalosporanicacid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊YangXin-Ji第二节β–内酰胺类一、结构与性质1.酸性（羧基）pKa2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素YangXin-JiNSO1234567NOS12345678第二节β–内酰胺类2.手性C（旋光性）﹡﹡﹡﹡﹡3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nmYangXin-Ji4.β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键)第二节β–内酰胺类干燥条件较稳定，溶液不稳定失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶某些氧化剂、金属离子、温度失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶YangXin-Ji第二节β–内酰胺类二、Identification(一)色谱法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光谱法IRUVNMRYangXin-JiCompanyLogo第二节β–内酰胺类NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2YangXin-Ji第二节β–内酰胺类YangXin-Ji第二节β–内酰胺类头孢利定的NMR鉴别法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示δ3.8附近δ6.9～7.5δ7.9～9.0单峰信号多重峰信号多重峰信号2：3：5YangXin-Ji第二节β–内酰胺类(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH2OH·HClNaOH羟肟酸Fe3+H+显色NSOH2NOHHClNSCOHNHOHNSCHNHOFe3+3O（红、棕、褐）2）茚三酮反应——α-氨基茚三酮Δ蓝紫色YangXin-Ji第二节β–内酰胺类CNH2H+OOHOHOCOHONCOO+CO2+3H2Oα3）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HHYangXin-Ji第二节β–内酰胺类4）变色酸-硫酸反应NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2H2SO4ΔHCHO变色酸（缩合）显色5）重氮苯磺酸反应——酚羟基橙黄色重氮苯磺酸OHHC56（偶合）6）铜盐反应——头孢氨苄的专属反应橄榄绿色NaOH4CuSOHAcYangXin-Ji7）硫酸-甲醛反应(BP)第二节β–内酰胺类呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲醛硫酸水湿润-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应——K+、Na+三、PurityTest(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定YangXin-Ji第二节β–内酰胺类色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40～120m）为填充剂，玻璃柱内径1.3～1.6cm，床体积50～60ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水100ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.93～1.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。对照品溶液的制备取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀YangXin-Ji第二节β–内酰胺类测定法取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%主成分自身对照法面积归一化法限量法自身对照外标法YangXin-JiOOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOHOOHCH2OOCH3OHOHOOOCH2OHHOOOOHOHOOH2COOOOOHHOH2COOH2COHHOOCH2OOOH2COOHHOOOOOHOOHCH2OOCH2OHHOOOOOCH2OHHOOOOCH2OHHOOOOH2COHHOOOOCH2OHHOOOOOOHOHOH2COOH2COHOCH2OHHOOOH2COCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHHCOHCH2CH2CH2HCOH萄聚糖凝胶立体网状结构图原理——“分子筛”第二节β–内酰胺类YangXin-Ji第二节β–内酰胺类2.有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查色谱条件与系统适用性试验：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:׃38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500异构体取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。YangXin-Ji第二节β–内酰胺类40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。BA△3-EEYangXin-Ji第二节β–内酰胺类有关物质取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，△3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)YangXin-Ji3.UV第二节β–内酰胺类4.有机溶剂5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)四、Assay碘量法汞量法酸碱滴定法