细胞示踪技术与应用(GFP)

1李京宝2011.11.25细胞示踪技术与应用(greenfluorescentprotein,GFP)2主要内容•GFP•GFP的研究历史•GFP的应用学习要点•基本特性•机遇与重视•开阔视野3GFP——基本性状4简介•绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP•最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。由水晶水母（Aequoreavictoria）中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm5分子结构•238aa,单链;•二聚体,β-桶状结构;•单体：11个β-折叠包围一个α-螺旋；•β-桶状结构直径约3nm，高约4nm，规则的氢键带；•其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域；6发光机制•生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。•六肽组成的发光中心•发光团（三肽）Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。•自身催化环化的结果•有氧过程，O2使Tyr66脱氢氧化。7特点•GFP荧光极其稳定；•中度氧化剂对GFP荧光影响也不大；•灵敏度高,抗光漂白能力强；•荧光的产生不需要任何外源反应底物。8GFP的研究历史——从下村修到钱永健9TheNobelPrizeinChemistry2008forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFPOsamuShimomuraMartinChalfieRogerY.Tsien钱永健马丁·查尔菲下村脩2008年10月8日10下村脩（1928年8月27日－），有机化学家、海洋生物学家1928年生于日本京都，1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位美国WoodsHole海洋生物学实验室（MBL）波士顿大学医学院名誉退休教授11小海萤（Cypridinahilgendorfii）1955,NagoyaUniversity,laboratoryofProf.YoshimasaHirata.12FridayHarbor,1961.AequoreavictoriaProf.FrankJohnson‘sLab,Princeton,NJ,195913ShimomuraO,JohnsonF,SaigaY(1962).Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea.JCellCompPhysiol59:223–39水母素aequorinGFP14600ringsperhour（10timesmorethanbyhand.）30–40bucketfulsofjellyfisheachday.1mgofAF-350150mgofpurifiedaequorin50,000jellyfish.2004151974年，纯化到了这个蛋白，时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。同年，荧光共振能量转移(FRET)在生物中发现“荧光素——GFP”1979年，GFP的发色基团确定酶解法161992年，DouglasPrasher拿到了GFP的基因（WoodsHole海洋研究所）(DouglasPrasher's)workwascriticalandessentialfortheworkwedidinourlab.Theycould'veeasilygiventheprizetoDouglasandtheothertwoandleftmeout.------MartinChalfieI'mreallyhappyforthem.Iwasreallysurprisedthatparticulartopiccarriedthatmuchweight.------DouglasPrasher17马丁·查尔菲（MartinChalfie，1947年－），美国科学家成长于美国芝加哥1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。18Chalfie,M.,Tu,Y.,Euskirchen,G.,Ward,W.W.,andPrasher,D.C.(1994),“Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression,”Science263:802–805.19钱永健RogerYonchienTsien（1952年2月1日－）美国生物化学家美国国家科学院院士美国国家医学院院士美国艺术与科学院院士圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。1977年-1981年，剑桥大学研究员。2021“……当然，我希望各个国家的年轻人都能受到激励，但我知道，中国人对此会尤其感到骄傲”。“可能因为我是华裔，很多中国人可能受到很大鼓舞，希望更多的中国年轻人也投身到基础理论研究中来。”“我是在美国出生长大的，我不是中国科学家……我的得奖有中国人高兴，如果这样让很多年轻人对科学发生兴趣，这是很好的事。”22GFP的应用——“看得见”的科学231、骨架和细胞分裂；2、细胞器动力学和泡囊运输；3、发育生物学；4、神经生物学；5、其他应用；24细胞骨架actintublin拟南芥胚轴微管-GFPAhairyrootofMedicagotruncatulaexpressingaGFPfusiontothemicrotubule25细胞分裂GFP-tubulin26细胞器动力学和泡囊运输TreatmentofstableHeLacellsexpressingEGFP-LC3withanautophagy-inducingsmallmoleculeincreasestheformationofautophagicvesicles(EGFP-positivepunctatestructures).Sarkaretal,NatChemBiol,3(6):331-338(2007).27发育生物学Longterm4DimagingofCaenorhabditiselegansembryo28神经生物学2930构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFPgfppMRP9-1电击转化FRD1FRD1-GFP31构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFPFRD1明视场观察激发荧光观察32Thanks！