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细胞培养准备一、无菌实验室二、常用的仪器设备三、细胞培养需要的物品四、细胞培养用液和培养基一、无菌实验室•组成：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与几个操作间相通。操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。二、实验室常用设备使用压力蒸汽消毒器1.使用前的准备：检查进气阀及排气阀是否关闭，并加入适量水。2.装放灭菌物：然后加盖旋紧螺旋，密封。3.预热及排气：4.升压保温：一般为103.43kPa，温度则相当于121.3℃时，持续15～20min即可达到灭菌目的。5.降压开盖取物：关电源，待其压力下降至零时，方可开盖取物。【使用方法】干燥箱•用于细胞培养的有些器械、器皿要烘干才能使用，玻璃器皿需干热消毒，因此，细胞培养实验室均配置有电热干燥箱。干热消毒时，升温较高，一般需达到160℃。水纯化装置•进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水；即使用于玻璃器皿的冲洗，至少也应是二次蒸馏水。•蒸馏水器、压力蒸气消毒器和电热干燥箱都是属于大功率电器，使用时一定要注意用电安全，尽量做到分开时间使用。超净工作台CO2培养箱•培养箱：控温及的提供所需的CO2，使培养液的pH保持稳定。•通常使用条件为37℃，5％CO2CO2供气凋节方法倒置显微镜离心机•进行细胞培养时，常需要制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等，因此要使用离心机。•平衡是关键电子分析天平冰箱细胞冷冻储存器1、冻细胞和组织2、注意液氮含量酸度计•酶标仪特殊设备•如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，使实验室工作做得更有效、更精确、更深入。有关的特殊或先进设备如下：•超低温冰箱，–70℃以下的冰箱便于储存有些试剂及标本；•荧光显微镜，进行荧光染色样本的观察；•更精确及快速检测细胞用的流式细胞仪等。三、细胞培养需要的物品：•1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。•2、蓝口瓶、离心管、吸管、冻存管、烧杯、量筒、饭盒、培养皿、封口膜•3、枪头（TIP头）•4、培养板，培养皿，细胞计数板•5、手术器械。•1、清洗•2、浸酸：•玻璃器皿浸泡到清洁液中–浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时•清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）–强清洁液63∶1000∶200–次强清洗液120∶200∶1000–弱清洁液100∶100∶1000•需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净3、消毒•物理消毒灭菌法–紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min–湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min–干烤：160℃,2小时–过滤：0.22μm•化学消毒灭菌法–75%酒精•主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理–1‰新洁尔灭•主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒•抗生素（主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染）四、细胞培养用液及培养基☆培养用液——水（三蒸水）平衡盐溶液（PBS）消化液☆培养基——天然培养基合成培养基配液前准备：•①滤器、磁力搅拌器、烧杯、•量筒、注射器。•贮液瓶（生理盐水瓶）、0.15Mpa，121℃，30分钟蒸气灭菌②NaHCO3、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养基粉剂平衡盐液体（Balancedsaltsolution,BSS）•组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分•如：PBS、Hanks•用途：用于洗涤组织、细胞或配制消化液时等•配制：购买+高压消化液——分散组织、细胞作用：（1）在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。（2）在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。类型：组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。特点：1、胰蛋白酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1：125和1：250两种。2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的活力。消化细胞时，加入一些血清（10%）或含血清的培养液，能终止消化作用。胰蛋白酶液(Trypsin)•称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许或PBS溶液调成糊状，再补足PBS，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡•次日，过滤除菌，分装入瓶中，-20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）。•如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。胰蛋白酶溶液配制：抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。一般市售市售链霉素为100万U/瓶培养基培养基——维持体外细胞生存和生长的溶液1、天然培养基2、合成培养基：合成培养基：RPMI1640，DMEM等。一般需加血清等•市场上可提供干粉培养基和液体培养基–干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制，配制时需要补加NaHCO3，调PH。配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。–液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便•根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3和谷氨酰胺。•加抗生素：•上述溶液配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。•大多数培养液中使用酚红作为pH指示–红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH四、灭活胎牛血清（FBS）与分装过程：•1、一般外购的血清只作过灭菌，在用前常需进行灭活处理。•2、热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清（加温到56℃，30min），以消除补体活性，未灭活血清应保存在–20℃冰箱。牛血清分装：•在无菌的条件下一般分装成10ml一管，贮存于-20OC.•使用时放置4OC冰箱过夜色解冻。