预防医学毒理chapter61

1掌握：基本概念、试验目的、急性毒性试验设计、LD50的计算方法及急性毒性分级；熟悉：急性毒性替代试验的方法、局部刺激试验的方法、蓄积毒性、亚慢性毒性、慢性毒性试验设计；了解:化学毒物所致的病理学改变及其评价。23一般毒性作用：也称为基础毒性，是全身各系统对外源化学物的毒作用反应。急性毒性作用重复剂量毒性作用亚慢性毒性作用慢性毒性作用急性毒性试验重复剂量毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验4特殊毒性作用致畸作用致癌作用致突变作用5为什么要研究外源化学物的一般毒性作用？6Section1急性毒性作用（acutetoxicity）7健康相关产品毒理学评价阶段与试验项目农药食品化妆品法规名称《农药安全性毒理学评价程序》GB15670-1995《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193.1-1994《化妆品安全性评价程序和方法》GB7919-87第一阶段急性毒性试验，皮肤与眼粘膜试验急性毒性试验急性毒性试验，皮肤与眼粘膜试验第二阶段蓄积毒性试验，致突变试验遗传毒性试验，致畸试验，短期毒性试验亚慢性毒性试验，致畸试验第三阶段亚慢性毒性试验，代谢试验亚慢性毒性试验，繁殖试验，代谢试验致突变，致癌短期生物筛选试验第四阶段慢性代谢试验，致癌试验慢性毒性试验，致癌试验慢性毒性试验，致癌试验第五阶段人体试验（激发斑贴、试用试验）acutetoxicity:是指机体（实验动物或人）一次或24小时内接触多次一定剂量外源化学物后在短期内所产生的毒作用及死亡。一、急性毒性的概念概念的解释：经口、注射器染毒，瞬间给予；经呼吸道、皮肤染毒，一段时间。24小时内多次接触：外源化学物毒性很低。短期内：最长的观察期限为14天。一次：获得急性毒性参数：LD50、LD100、LD0等；初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性；二、急性毒性试验的目的11为重复剂量、亚慢性和慢性毒性试验等后续试验提供接触剂量设计依据，并为观察指标的选择提出建议；为毒理学机制研究提供初步的线索。经典急性毒性试验设计：急性毒性替代试验：LD50应用中的有关问题：急性毒性分级和评价：三、急性毒性试验方法的要点13（一）经典急性毒性试验的设计实验动物染毒途径试验周期与毒效应观察染毒剂量与分组14选择的原则：选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的实验动物；品系纯化；价格较低和易于饲养和获得。实验动物的选择15实验动物的选择实验动物的种属和品系；实验动物的年龄和体重；实验动物的性别；动物数量；实验动物的预检；禁食。16实验动物的选择1.实验动物的种属和品系：种属：最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔；非啮齿类：狗或猴。大鼠为首选的啮齿类动物。17实验动物的选择品系：起源于共同祖先的一群动物。依据遗传学背景分类：近交系（Inbredstrain）杂交群（Hybridstrain）封闭群（Closedcolony），如：昆明种小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠等。18实验动物的选择大鼠——180~240g家兔——2~2.5kg小鼠——18~25g狗——10~15kg豚鼠——200~250g2.实验动物的年龄和体重：同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。19实验动物的选择3.实验动物的性别：雌雄各半；化学毒物对雌、雄动物的毒效应有明显差异时；致畸试验，可仅作雌性动物的LD50测试；实验动物必须是未曾交配和受孕的动物。20实验动物的选择4.动物数量与分组大、小鼠等小动物---每组10只狗等大动物---每组6只几组？21实验动物的选择动物分组：改进寇氏法至少设5个剂量组；概率单位图解法一般设6~10组；霍恩法设4个剂量组；分组方法：随机分组。22实验动物的选择5.实验动物的预检：通常情况下观察5~7天，剔除异常的动物，选择健康动物；检疫期与实验期雌雄动物分笼饲养，防止交配及受孕。23实验动物的选择6.禁食：大鼠应隔夜禁食；小鼠应禁食4h；大动物可在染毒前不喂食，染毒后继续禁食3~4h；要保障饮水的供应。24选择的原则：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。染毒途径的选择25染毒途径的选择最常用的染毒途径为：经口；经呼吸道；经皮肤；注射途径。26染毒途径的选择经口染毒：灌胃、喂饲、吞咽胶囊；经呼吸道：吸入染毒、气管内注入；经皮肤染毒：动物背部皮肤、小鼠浸尾法；注射途径:腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮下注射。27染毒途径的选择各种染毒途径都有一个最大染毒容量的问题：小鼠一次灌胃体积0.21.0ml/只；大鼠一次灌胃体积1.04.0ml/只；豚鼠一次灌胃体积1.0~5.0ml/只；28了解理、化性质染毒剂量及分组预实验正式试验查阅文献291.查阅文献有相关毒性资料可供参考者；没有相关毒性资料可供参考者30（1）有相关毒性资料可供参考者找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50值作为受试化学物的预期毒性中值。设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计1~2个剂量作为预试验剂量。31（2）无相关毒性资料可供参考者以最大耐受量作为实验的最高剂量；以1mg/kg为最低剂量组，组距为4，进行预实验。322.预试验找出10%~90%或0%~100%致死剂量的范围，然后在这个剂量范围内以合适的间距设几个剂量组，作为正式试验的剂量。333.正式试验组数的确定：LD50的计算方法：改进寇氏法（karber’smethod）序贯法（sequentialmethod）Bliss法霍恩法（Horn）34改进寇氏法至少设5个剂量组；概率单位图解法一般设6~10组；霍恩法设4个剂量组；设立对照组；采用随机化分组的方法。35可根据以下公式计算出组距i值：i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1)或i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)式中：i为组距（相邻两个剂量组对数剂量之差）n为设计的剂量组数36剂量分组求得i值后，以最低剂量组（lgLD0或lgLD10）的对数剂量加上一个i，既是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。37毒效应的观察观察期限：一般为14天；也可依据毒性反应、症状发生的速度和恢复期的长短而定。38毒效应的观察急性毒性试验的观察和记录内容主要包括：中毒体征及发生过程；体重和病理形态学变化；死亡情况和时间分布。391.中毒体征及发生过程试验过程应详细地观察和记录动物出现的中毒症状、发生的时间、症状发展的经过，死亡前的特征以及死亡时间等。40表6-1啮齿类动物急性中毒表现412.体重和病理形态学变化体重的变化：病理形态学变化：对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查。根据实验目的可增加检测指标：体温、心电图、电图或进行某些生化指标测定等。423.死亡情况和时间分布重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。43表急性毒性实验原始记录受试物名称：受试物性状：受试物来源：动物物种品系：动物来源及合格证号：染毒途径：室温：相对湿度：组别剂量动物编号性别体重(g)染毒量(ml)染毒时间体征及出现时间死亡时间44LD50的计算方法以改进寇氏法为例：本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，个剂量组距组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，要求最低剂量组死亡数＜20%，最高剂量组死亡率＞80%。45计算公式如下m=Xk-i(∑p-0.5)pqSmin式中：m——lgLD50;i——相邻两剂量组之对数剂量差值Xk——最大剂量的对数值p——死亡率q——存活率（1-p）∑p——各剂量组死亡率总和n——每组动物数46举例：小鼠经口给予某种化学毒物染毒，剂量和死亡动物数结果见表：组别剂量动物数(n)死亡数(只)死亡率(p)存活率(q)p.qmg/kg对数115.01.17611000.01.00.00218.01.25611020.20.80.16321.71.33611050.50.50.25426.11.41611070.70.30.21531.31.49611090.90.10.09i=0.08∑p=2.347LD50的计算方法：m=Xk-i(∑p-0.5)lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)=1.3521=0.0213lgLD50及其95%可信限为：1.3521±1.96×0.0213LD50及其95%可信限为：？pqSmin48又称“3R”法，即:优化（refinement）:试验方法和技术，减少（reduction）：受试动物的数量和痛苦，取代（replacement）：整体动物试验的方法。（二）急性毒性替代试验49固定剂量法急性毒性分级法上-下移动法50固定剂量法（fixeddoseprocedure）观察终点：不以死亡为观察终点，而是以出现“明显毒性”作为观察终点。染毒剂量：5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。51固定剂量法具体方法：试验分为2个阶段进行。预实验阶段：正式试验阶段：52固定剂量法和经典急性毒性试验的比较毒性反应无明显差异；毒性分级基本一致；固定剂量法可以获得较全面的危险度评价资料。53固定剂量法优点：所用动物数少测定一个化合物的LD50，固定剂量法平均用大鼠14.8只，经典方法平均用大鼠24.2只。动物死亡率低。54急性毒性分级法（acutetoxicclassmethod）观察终点：以死亡为终点；染毒剂量：25、200、2000mg/kg；实验动物：啮齿类，首选大鼠。55急性毒性分级法具体方法：从25、200、2000mg/kg3个固定剂量中选择一个剂量开始进行试验，每阶段3只动物，根据死亡动物的数量来判定大致的LD50值范围，直接进行危害评估和毒性分级。56急性毒性分级法结果判断：不需要进一步试验进行分级；下一阶段以相同剂量的另一种性别试验；下一阶段以较高或较低的剂量水平进行。优点：所用动物数少。57上-下移动法（up/downmethod）观察终点：以死亡为终点，但也可以观察不同的终点。具体方法：用1只动物序贯进行，观察48h，不死亡，下一只提高一档剂量，死亡，就降一档剂量做。但每一只存活动物都需观察至14d，后期死亡动物在统计结果时也要记为死亡。58上-下移动法剂量设计：推荐采用剂量序列1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000或5000mg/kg；具体从哪个剂量开始，要参照已有的资料。对于无毒性资料可以参考，推荐从175mg/kg开始。59上-下移动法试验终止的条件：设立了3种实验可以终止的判断标准，满足其中之一即应停止进一步的动物试验。优点：动物数量少，只需要6~9只动物。601995年Lipnick等比较了上下法、固定剂量法和经典法，上下法和经典法一致性为23/25，上下法与固定剂量法一致性为16/20。上下法需单性别动物6~10只，少于另两种方法。三种替代方法的比较61（三）LD50应用中的有关问题LD50的意义LD50的局限性62LD50的意义标准化药物毒作用强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小；计算药物的治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离；为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考；63LD50的意义通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息；试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副反应提供监测参考。64LD50的局限性获得的信息较少，实用性有限；LD50的波动性很大，影响因素很多；物种差异对LD50影响大；传统计算LD50的方法消耗的动物量大。65（四）急性毒性分级和评价现行的各种急