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肝炎分子诊断项目开展介绍---艾迪康市场部目录1、了解肝炎分子诊断2、分子诊断在HBV中的临床应用3、分子诊断在HCV中的临床应用4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目我国乙肝病毒感染率概况《2006－2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划》显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国家，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒。目前全国慢性乙肝病人2000万人，每年死于与乙肝相关的肝病患者达28万例，发病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接经济损失约达3600亿元人民币。我国乙肝病毒感染率概况什么是分子诊断在临床上应用核酸（DNA/RNA)和分子生物学技术,在基因水平诊断和监控疾病情况和疗效，评估疾病的检测方法。分子技术在乙肝诊断与治疗中应用HBV分子诊断的临床应用高灵敏度HBVDNA定量HBV感染监测药物疗效检测感染早期检测HBV基因分型病情预后发展检测抗病毒药物效果预测P区耐药检测抗药性监测治疗药物选择S区变异确定隐觅性病毒变异判断疫苗效果判断肝炎预后C区启动子变异确定病毒变异类型判断治疗效果确定治疗方案高灵敏度乙肝DNA检测•高精度病毒载量检测系统（COBASAmpliPrep/CobasTaqMan）高灵敏度乙肝DNA检测优势•定量PCR技术检测患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度，对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。•QF-PCR是国内常用的定量检测血清HBVDNA水平的方法，COBAS系统是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测的方法。它具有灵敏度高，线性范围广，实时监控，重复性好，可检测A、B、C、D、E、F、G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。•由于本QF-PCR试剂盒的线性范围为1.0x103copies／mL～1.0x108copies／mL，对于低于1.0x103copies／mL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏检的可能。而COBAS系统线性范围为20-1.7×108IU/mL，因此，COBAS系统更能准确反映血清HBVDNA含量。COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HBVTest,v2.0COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HBVTest,v2.0检测灵敏度20IU/mL线性范围20–1.7x108IU/mL检测基因型A-H检测样本量650mLSampleType血清或EDTA抗凝血浆SFDA注册证Q3Cobas®高灵敏度乙肝：20IU/mL准确判断治疗起点/终点线性范围乙肝：20-1.7×108IU/mL极佳的重复性，结果可靠正确指导抗病毒治疗每批试剂均使用WHO标准品校准保证定量结果的准确性和可溯源性每个样本使用同源性内标定量避免结果不准确采用AmpErase酶减少交叉污染目前在国内唯一满足治疗指南和专家共识的HBVDNA和HCVRNA检测试剂HBVDNA监测的重要性口服核苷（酸）类似物疗效评估部分病毒学应答60–2,000IU/mL加其他药物治疗每3个月监测HBVDNA开始治疗---基于HBVDNA、ALT水平和疾病发展阶段治疗第12周评估是否存在原发性无应答(较基线下降1log)治疗第24周评估完全病毒学应答60IU/mL继续治疗每6个月监测HBVDNA不充分病毒学应答2,000IU/mL改用或加用更强药物每6个月监测HBVDNA*Keefe,E.ClinGastroHepatology.2007;(5):890-897.抗病毒治疗应将HBVDNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量PCR方法（灵敏度10-15IU/mL）的最低检出限11.EASLHBVGuidelines.JHepatology.2009;50:277-242CHB疾病管理:治疗目标HBsAg清除及血清学转换治疗终点ALT正常组织学改善HBVDNA降低/消失HBeAg血清学转换HBeAg消失cccDNA清除*Lok,A.S.Fet.al.“ChronicHepatitisB:Update2009.”HEPATOLOGY,Vol50,No.3,2009,pgs8-9治疗终点•2009年EASL指南提出的治疗终点：•最理想的治疗终点：持续的HBsAg消失，伴或不伴抗HBs抗体出现。•满意的治疗终点：在HBeAg阳性患者中，出现持续的HBeAg血清转换•次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒DNA水平（降至实时定量PCR检测限以下：10-15IU/ml）HBV基因分型根据HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8个型不同的基因型具有不同地域分布我国主要是B\C型为主，偶有A型北方－C型HBV基因分型检测临床意义特征基因型B型C型感染性低高HbeAg阳性率低高HbeAg自然清除时间短长HBVDNA载量低高致病性轻重HCC发生率低（低年龄组高）高（高年龄组高）干扰素治疗完全应答率高低抗病毒治疗效果高低肝癌手术治疗预后好差癌栓栓塞治疗效果好差HBV变异的基础•乙肝病毒:高变异性1/105•24h一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万—一亿•复制过程:DNA-RNA-DNA•HBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制•变异:自然变异,免疫压力等等原本有效的药物对发生耐药变异后的病毒束手无策变异前，药物有效抑制病毒变异后，药物对病毒束手无策乙肝病毒P区耐药P区耐药位点检测HBV病毒耐药性检测•长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区•原因：抗病毒药物作用在病毒P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐药。抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药原发无应答病毒学（部分）应答临床耐药抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药病毒耐药的临床影响耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹,血清转氨酶升高,HBeAg血清转换率降低肝脏病理进展肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高公共卫生危害耐药病毒株的传播免疫逃逸Liawetal.1999.Hepatology30:567病毒的水平越低，耐药发生的几率越低初治患者耐药发生率23014.42.7463121.68.6551117118296501020304050607080拉米夫定阿德福韦(eAg-)恩替卡韦替比夫定(eAg+)替比夫定(eAg-)1年2年3年4年5年拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率P区耐药位点检测•长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区•耐药基因分析在临床药物选择上的应用目前最常见P区耐药位点11个（169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250）拉米夫定M204I/VL180MV173L恩曲他滨V173LL180MM204I/V阿德福韦A181VN236T恩替卡韦T184A（G/I/S)M250V特比夫定M204I/V常用抗病毒药物的耐药位点常见变异的交叉耐药性敏感界于中间耐药拉米夫定替比夫定恩替卡韦阿德福韦替诺福韦野生型SSSSSM204IRRISSL180M+M204VRRISSA181T/VISSRSN236TSSSRIL180M+M204V/I±I169T±V173L±M250VRRRSSL180M+M204V/I±T184G±S202I/GRRRSS抗病毒药物的选择和使用1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药位点药物代替2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用具有两种不同耐药位点药物一起治疗3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现药物治疗效果不佳时需排除产生耐药的可能药物治疗慢性乙肝患者管理路线图检测检测检测检测耐药检测项目•目前检测的变异位点：P区耐药位点11个（169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250）•专门检测LAM变异位点：180，181，204，173•专门检测ADV变异位点：181，233，236艾迪康医学检验中心P区基因变异检验报告单样张丙型肝炎病毒传播途径:主要血液/体液传播(似HBV)是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上免疫力不牢固•黄病毒科丙型肝炎病毒属•球形有包膜的RNA病毒，直径50nm•病毒基因为单股正链RNA，链全长约10KbHCVRNA检测•确定引起病毒性肝炎的直接原因•通过病毒数量变化来监测治疗效果实时荧光PCR法：检测三个基因型（1型、2型、3型）PCR产物直接测序法：1-6型及亚型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6kHCV基因分型专用申请单病程，病史目前用药情况，服药时间肝炎分子诊断综合检查申请单姓名必填性别（必填）□男/□女年龄必填门诊号科别住院号病房床号送检医院送检医生必填医生联系电话必填采集时间（必填）年月日时送检时间（必填）年月日时临床印象：□乙肝□丙肝□混合性肝炎□肝硬化□肝癌□肝纤维化现病史（临床表现以及病程）抗病毒药物使用情况：□拉米夫定(贺普丁)____年月至____年月□阿德福韦(贺维力)____年月至____年月□恩替卡韦____年月至____年月□替比夫定____年月至____年月□替诺福韦____年月至____年月□干扰素____年月至____年月□恩曲他滨____年月至____年月检测项目（注意：请在要检测的项目前打“√”确认）★核苷类似药药物敏感性□HBVP区耐药检测□拉米夫定耐药检测□阿德福韦酯耐药检测★e抗原阴性□HBV前C区和C区变异检测□HBV前C区1896位点检测(荧光定量PCR法)□HBVC区1762/1764位点检测(荧光定量PCR法)★预后及动态监测□高灵敏度HBV-DNA（罗氏COBAS：最低检测下限12IU，EDTA抗凝血浆2ml，适用于常规乙肝定量阴性的患者）□HBV基因分型(测序法：8个基因型)□HBV基因分型(荧光PCR法：2个基因型)□HBV前S区和S区变异检测□HCV基因分型(测序法：6个基因型及其亚型)□HCV基因分型(荧光PCR法：1a、1b、2a、2b、2c、3a)□其他肝炎病毒核酸检测(荧光定量PCR法)标本类型（必填）□血清□EDTA抗凝血浆（紫头管）□粪便（HAV、HEV核酸检测）备注1、采集血清(浆)量2ml，抗凝血标本请将血浆分离后送检，粪便请使用专用粪便采集器送检具体详见传染病项目标本取材及物流注意事项；2、对于收集后当天进行检测的血清（浆）样本，可在4oC条件下保存运送，如需长期保存请保持-30oC以下条件冰冻保存；粪便样本请在4oC条件下48小时内送达实验室。3、为了能及时并准确检查及诊断，请详细填写本申请表；BarCode条形码粘贴处第一联检验中心联第二联送检医院联谢谢！