肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究

项目名称：肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究首席科学家：徐平中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：总后勤部卫生部二、预期目标1．总体目标本课题研究的总体目标是充分发挥我国在肝病模型、标本和肝脏蛋白质组研究方面的优势，利用定量蛋白质组学的原理和方法，对肝病发生发展过程中磷酸化、泛素化、糖基化蛋白质本身及其异质体的修饰位点、修饰类型、计量关系和动态变化规律以及控制机理进行系统研究。考察这些翻译后修饰在肝病病因、预后和治疗中的价值。通过本研究，我们将建立高效率、低成本的蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化修饰和糖链结构解析的定性、定量研究技术；揭示肝病发生和癌变过程中磷酸化蛋白质信号通路的开关机制、泛素化调控的蛋白质量变引起质变的规律以及糖基化在肝癌发生发展和转移中的变化趋势，阐明这些翻译后修饰在肝病发生发展中的生理病理机制；筛选、鉴定一批具有诊断和药靶意义的肝病相关翻译后修饰蛋白或翻译后修饰调控蛋白。本项目的开展将加速我国定量疾病蛋白质组学研究体系的形成，培养一批从事蛋白质翻译后修饰研究的专门人才，产生一批具有国际影响力的论文和成果，继续保持我国肝病蛋白质组学研究基地在国际上的竞争优势。2．五年目标1）发展一套高通量、高准确度和高精度的磷酸化、泛素化和糖基化蛋白质组的定性、定量研究技术及平台。2）系统比较在肝细胞癌发生发展过程中，HBx侵染宿主细胞后引起宿主细胞蛋白质磷酸化修饰进而导致HCC的分子机制，和肝细胞极性蛋白磷酸化修饰及其调控的下游蛋白磷酸化在肝细胞癌发生发展中的作用机制。阐明该过程信号途径和调控网络；发现肝病发展过程中磷酸化控制的关键蛋白；探索这些验证的关键蛋白作为药靶和肝病标志物的可能性。3）建立特定泛素链形成和脱泛素化的酶学决定机制和关系网络；筛选以Smurf1、NEDL1/2和SCF为代表的特异性泛素化蛋白质；构建2个E3基因敲除小鼠模型，鉴定8-10个新的E3调控蛋白，揭示2-3类新的E3活性调控机制；获得2-3个在肝癌发生发展过程中发生显著变化的泛素连接酶，提供1个候选肝癌标志物。4）发展一套基于质谱数据的糖链结构计算机算法和聚糖结构解析芯片；建立肝病相关糖蛋白/核心岩藻糖化糖蛋白数据库；发现和鉴定100个与肝病相关的糖蛋白，10个有早诊和药靶意义的聚糖结构；解析2-3个糖蛋白聚糖的宏观和微观的不均一性与功能表达的关联和与肝病的联系；确认2－3种与肝病发生发展和转移密切相关的重要糖蛋白及其配基；阐明1-2个关键糖基转移酶家族成员表达调控及在肝癌发生发展中的分子机制；探索差异调控1－2种蛋白质糖基化修饰的生物学机制。5）在国际核心刊物发表论文50篇以上，其中影响因子10以上的3-6篇；申请发明专利10项。6）造就一支蛋白质翻译后修饰高水平的科研队伍，培养国家杰青人才1名以上、培养博士和硕士研究生50-80人。三、研究方案1．学术思路本项目立足于我国重大肝病的国情，意图在原有肝脏蛋白质组学和大规模表达谱、翻译后修饰谱研究的基础上，选择研究基础好、与肝病发生发展和状态特征关系密切的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化展开研究。在改进基于质谱的磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白高通量的定性和定量研究技术的基础上，结合已经建立的系列肝病相关的细胞、动物模型和临床标本，系统研究与肝病发生发展相关的蛋白质及其异质体的动态表达差异、调控规律和翻译后修饰信号识别的分子机制，进而揭示蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰与肝病关联的生理病理学意义。本研究项目需要蛋白质组学、生物信息学、遗传学、生物化学、基因组学、分析化学和糖生物学等各交叉学科团队的通力合作，而其产生的科研成果又将施惠于各个研究领域。2．技术途径本课题的技术途径包括肝病蛋白质及其翻译后修饰体差异的发现、差异相关的调控途径和网络研究以及重要功能蛋白的功能表征等3个层面的多种途径。1）蛋白质及翻译后修饰体差异谱的产生技术：改进已有的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化鉴定、定量技术，结合我国在系列肝病模型和疾病标本方面的良好积累，利用代谢过程标记技术产生的重稳定性同位素完全标记蛋白质组为定量内标，进行多维LC-MS/MS或GeLC-MS/MS的蛋白质及其修饰异质体的定性鉴定和定量分析。对发现的差异利用可视化蛋白质及其修饰体差异显示技术等假阳性排除技术进行数据过滤，并用质谱多反应监测技术（MRM）进行验证。2）参与蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化调控的酶学机制和信号途径研究：利用基因敲除、基因敲入细胞株、肝病细胞或小鼠模型，结合代谢过程标记的重稳定性同位素标记内标和基于MRM的翻译后修饰酶系目标导向定量蛋白质组技术，巧妙避开复杂蛋白质组样品和当前仍然有限的蛋白质组学鉴定能力之间的矛盾，定量比较、建立肝病相关翻译后修饰调控的信号途径。3）重要功能蛋白的表征研究：利用分子生物学技术，在体外生化反应体系、基因工程细胞和小鼠模型进行重要肝病相关蛋白的功能验证和分子生物学机理探索。3．创新性和特色本课题的创新之处集中表现在：1)首次围绕重大肝病进行多个蛋白质翻译后修饰系统研究，有利于发现不同修饰间的交互影响，阐明翻译后修饰相关的肝病病理生理机制；2)发挥我国在肝病模型和标本方面的积累和优势，注重重大疾病相关生物学问题的解决，变经典的定性数据积累型蛋白质组学研究模式为假设驱动型定量蛋白质组学研究；3)不仅在组学水平系统调查蛋白质及其翻译后修饰异质体在肝病发生发展转移过程中的质和量的变化，而且监测影响这些变化的翻译后修饰酶学决定机制，便于计算生物学和生物信息学技术的整合，并形成肝病相关蛋白质翻译后修饰系统生物学研究模式阐明肝病的本质；4)系统集成和发展蛋白质翻译后修饰研究的系列关键技术，解决蛋白质泛素化和糖基化修饰鉴定的国际性难题。本课题的特色在于：1)目标清晰，着眼于我国重大肝病的国情，问题明确，注重阐明翻译后修饰相关的肝病机理；2)方法新颖，立足于建立系统的蛋白质翻译后修饰的位点、种类、化学计量及翻译后修饰相关酶的规模化、高精度的定量动态化研究技术，假阳性排除技术、分析策略和生物信息学整合途径，着眼于这些研究成果在我国高发的肝病，特别是肝癌的发生、发展过程中亟需解决的问题上的应用，结论于临床医学对实验基础科学分析结果的严格验证，研究内容间环环相扣；3)集群效应突出，组合我国在分析化学、蛋白质组学、细胞生物学和生物信息学优秀团队，充分发挥各团队的专长开展相关研究。4．取得重大突破的可行性分析本项目瞄准了当前蛋白质组学研究的热点、重点、难点问题和国家急需，充分利用项目组在研究队伍、研究资源和技术上的优势进行联合攻关。资源优势：项目参与单位已经积累了本项目研究所需的肝癌细胞系（包括不转移和具有不同转移潜能的肝癌细胞）、肝病的基因敲入、敲除细胞株和小鼠模型、肝癌高发现场以及正常人和早、中、晚期肝癌患者及相关肝病的组织和血清标本库，具有广泛的样本积累。这为肝病相关蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化的系统研究提供了资源保证。技术优势：本项目试图整合蛋白质翻译后修饰蛋白质组学技术和定量蛋白质组学技术，结合肝病发生发展各阶段的生物学模型，系统考察蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化在肝病病因、进程以及预后中的作用、变化规律和调节机制。在深入研究疾病相关翻译后修饰及其调控的信号途径的基础上，结合目标导向的定量蛋白质组学技术系统地筛选和发现肝病相关的翻译后修饰蛋白及其调控的信号途径。项目的研究思路新、基础实。参加本项目的所有课题都建有先进的蛋白质组学研究平台，研究水平处于国际前列。在蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白质组学研究方面已经建立了技术体系。代表着国内蛋白质组学、翻译后修饰的研究水平。研究队伍的优势：本项目集中了我国北京、上海两地在蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化、糖生物学及糖化学研究领域中的优势力量。项目组包括2个国家重点实验室（蛋白质组学国家重点实验室、分子生物学国家重点实验室）和3个省部级重点实验室（教育部癌变和侵袭原理重点实验室、卫生部糖复合物重点实验室、中国科学院上海生命科学研究院蛋白质研究分析中心）。课题负责人和主要学术骨干都由具有多年研究经验和高度组织能力的学术带头人担任，并都曾经有过主持或参与国家重大项目的经历，在项目的有效执行及管理上有丰富的经验。绝大多数成员都有在美、日、欧等发达国家的先进实验室多年的工作经历和长期与国外先进实验室合作的经验。多数成员已在蛋白质组学、生物信息学、蛋白质磷酸化、糖基化和泛素化等领域具有多年的研究经验，均做出过重要贡献，在Cell,Science,NatureCellBiology,NatureBiotech,NatureMethod,CancerCell,Gastroenterology,Hepatology,PNAS,EMBOJ,MCP等国际顶尖刊物上发表过论文。综上所述，我们有信心完成本项研究，实现各项预期目标，获得一批创新性的研究成果，并在肝病蛋白质翻译后修饰领域取得突破，以保持我国在肝病蛋白质组学研究领域的国际领先地位。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年共性技术：1、建立重稳定同位素体内体外标记相对定量方法。2、翻译后修饰鉴定算法及质控的研究，蛋白质翻译后修饰数据库的研发3、研究HBx基因敲入小鼠肝癌模型在不同肝病发展阶段泛素化水平的差异，确定泛素化蛋白组取样节点和方法。4、发展基于多反应监测（MRM)的绝对定量方法。有标及无标蛋白质定量方法的算法研究。肝病标本：1、收集、整理肝癌标本，建立和完善肝相关疾病的样本库。2、建立完善转移相关生物样本库肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、系统优化并建立一套高通量、高效率的磷酸化肽段在线富集、鉴定新技术。2、HBx稳定表达的肝细胞模型（HBx转染Changliver细胞）的构建及IGF2刺激条件的优化；细胞表型检测（细胞增殖能力及成瘤能力）。3、Cdc42调控的蛋白泛素化在急性肝损伤中的作用及分子机理；Cdc42调控的蛋白磷酸化在胆汁酸平衡中的作用及分子机理研究。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、以Nedd4泛素连接酶（E3）家族成员的WW结构域与HECT结构域为诱饵，通过酵母双杂交筛选相互作用蛋白。2、启动建立泛素连接酶NEDL1、NEDL2的条件型敲除小鼠模型。3、研究泛素连接酶Smurf1与SCF类E3FBXL15的相互作用及其对Smurf1的稳定性调控作用。4、启动真核细胞中13个泛素铰链酶E2单敲共性技术：1、结合高精度质谱分析，实现大规模蛋白质翻译后修饰位点的鉴定。2、建立从图谱、序列、修饰类型和修饰位点全方位的质控。3、建立肝病蛋白质组定量内标制备技术，制备本课题所需的定量内标。4、重稳定性同位素体内体外标记相对定量方法一次可获得1000个以上蛋白质的定量信息。肝病标本：建成完备的肝相关疾病的生物样本库（500例组织、血清）和病理随访数据库。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、确定并建立一个能够进行无富集偏好性、高通量的磷酸化富集技术平台。2、得到HBx稳定表达的Changliver细胞株，明确IGF2刺激Changliver细胞的最优条件。并通过对所得细胞株进行增殖能力、成瘤能力的检测，确定细胞模型构建成功。3、明确Cdc42调控的蛋白泛素化在急性肝损伤中的作用，并对其分子机理有较明确了解。阐明Cdc42调控的蛋白磷酸化在胆汁酸平衡中的作用及分子机理。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、获得一批新的Nedd4家族E3结合蛋白，完成酵母回转验证。2、完成两个敲除小鼠的打靶载体构建、中靶ES细胞筛选。3、揭示Smurf1稳定性受SCF类泛素年度研究内容预期目标除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。5、启动真核细胞中18个脱泛素化酶DUB单敲除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。6、启动真核细胞中泛素活化酶E3单敲除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、新型硼酸修饰材料的发展；2、糖肽质谱行为研究；3、发展糖代谢标记技