体内药物分析ppt课件

体内药物分析Biopharmaceuticalanalysis体内药物分析概述一、体内药物分析的定义研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质和量变化规律的分析方法学。药物分析,法医鉴定,毒物分析二、体内药物分析的意义（一）在新药评价和开发中的意义1．全面质量控制(毒奶粉事件)药品三原则:安全,合理和有效2．新药报批3．为设计新药提供信息①从代谢产物中开发新药(保泰松和羟基保泰松)②前药设计③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决1．血药浓度与药理作用思考题:剂量增加,药效是否成正比增加???（二）临床合理用药中的意义2.影响血药浓度的因素（1）机体因素a．生理因素:年龄、性别、生理状况（妊娠期）b．病理因素（胃肠道、肝脏、肾脏）c．遗传因素（乙酰基转移酶代谢异烟肼、乙醇脱氢酶）（2）药物因素a．剂型因素（生物利用度问题）b．药物合并使用（酶抑、酶促）c．环境因素（环境污染、食品、个人精神状态）分析目标药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性,它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价特别重要.机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程,其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关母药药物特有代谢产物体内内源性生物活性物质三、体内药物分析的对象CompanyLogo药物在体内的形态游离型代谢产物游离型原药结合型原药结合型代谢产物情形极为复杂缀合物分子间力结合化学共价结合称为两类四、体内药物分析的特点1．干扰杂质多(内源性物质,分离纯化)2．样品浓度低(富集,净化)3．取样量少4．工作量大5．时间短6．有一定设备五、体内药物分析方法1.色谱分析法：TLC、、GC、HPLC、HPCE2.免疫分析法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等3.生物学方法：微生物学方法用于抗生素类药物的体内分析，如生物利用度，生物等效性或临床TDM等体内样品测定12第一节常用体内样品的制备与贮藏一、生物样品的采集与贮藏体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。（一）样品的采集1．血样血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液2．尿样目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分离优点：易得，属非损伤性取样，样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。缺点：与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。3．唾液唾液是无损伤性采样，易采集。一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓(P)密切相关，因此，在TDM中可利用测定S代替P监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。优点：不受时间和地点的限制，可反复采集，采集时无痛苦、无感染危险；唾液成分比血液、尿液简单，提取方便，有时可直接上样测定；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。16缺点：唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动。S/P只有少数药物是恒定值。蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度低。对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。（二）样品的贮藏1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏，-70℃加入稳定剂NaF2．尿样①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4℃保存②加入防腐剂a．1%甲苯b．饱和氯仿c．pH改变3．唾液：同血样18第二节生物样品的预处理与制备30%以上工作和费用用在样品前处理上二、生物样品的预处理（一）预处理的目的将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物的总浓度将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来（分离浓缩）防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性等（出现浑浊和沉淀，杂质多，与试剂起反应，影响色谱柱寿命）（二）处理方法选择的一般原则1．药物理化性质pKa亲脂性挥发性溶解度光谱特征稳定性2．浓度范围灵敏的方法3．测定的目的定性定量母体代谢4．生物样品的种类5．样品处理与分析方法的选择①专一性②灵敏性处理步骤与方法全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取放射免疫分析残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS去除蛋白质方法分离与富集方法微透析技术缀合物水解化学衍生化萃取如何进行？常用体内样品预处理方法CompanyLogo蛋白质的去除加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)缀合物的水解酸水解(盐酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有机破坏(硝酸-高氯酸消化)分离、纯化与浓集液-液萃取法(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解剂法(硝酸-高氯酸消化)常用体内样品预处理方法（三）生物样品去蛋白处理目的：去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限1．加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀剂三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点3．组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解②可改善对蛋白结合率强的药物的回收率③不产生乳化4．其他加热超滤（四）生物样品缀合物水解1．酸水解：0.1mol/LHCl，100℃，30min，条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。2．酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37℃数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。3．溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：CompanyLogo是以多孔半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术，选用不同的孔径的不对称膜，即可按照分子量大小进行分离适合TDM血样分析Therapeuticdrugmonitoring（五）超滤分离法why?某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生HowforGC?硅烷化酰化烷基化不对称化（六）化学衍生法CompanyLogo某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生HowforLC?UVFL非对映衍生化31（五）分离、纯化与浓集有差别才有可能分离！生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？生物样品的萃取优点：①与杂质分离②简便③浓集④提取率高1、液液萃取法原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。33采用LLE要考虑的几个问题（1）溶剂的选择与纯度要求纯度AR以上①了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用②对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）③沸点低、易挥发、浓集④与水不相混溶⑤无毒，不易燃烧⑥不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）⑦具有较高的化学稳定性和惰性⑧不影响紫外测定毒性大的尽量不用34（3）水相的PH值主要由药物的pKa决定！（2）有机溶剂相和水相的体积比1∶1或2∶1由实际情况决定，文献中有的10∶1以上生物样品一般多在碱性下提取！35由于血药浓度较低，提取时需浓集传统的浓集方法主要有两种：一种是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适合的溶剂溶解后测定。36衡量提取方法优劣的一个重要指标就是提取回收率，它是指药物从生物样品中被分离出来用于测定的比例，一般应高于60%----乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%药物的萃取37文献上常提到的LLE的缺点传统萃取方式回收率低、样品用量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂毒性大、易乳化、不能自动化操作38关于固相萃取小柱：a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20μm)和填料(多为40-60μm，80-100μm)。b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml为例：其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。2.固相萃取(SolidPhaseExtraction，简称SPE)法39SPE填料亲脂型:大孔吸附树脂，亲脂性键合硅胶。亲水型：硅胶、硅藻土。离子交换：苯磺酸基，羧基等。40固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。平衡——水或适当缓冲液冲洗小柱。上样——将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液淋洗——水或缓冲液最大程度除去干扰物。洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：4142亲水型填料用作SPE的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉纤维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水基质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布于流动相，从而达到萃取的目的。亲水型填料SPE有较高的萃取回收率（大于80%），但洗脱剂用量较大（一般大于5ml），无浓集作用，萃取液较干净。43SPE优点：1、不发生乳化；2、适应的极性范围较广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的应用已比较普遍。最大的缺点：贵20多元/支44三种方法的优缺点比较第三节体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的灵敏度专属性色谱法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反应，重现性生物学方法++特异性较差，需与色谱法平行使用二、分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进→创新创立方法1．做好文献总结2．充分了解药物特征及体内状况pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3．明确测定目的、要求目的4．结合实验室条件设备条件预处理方法药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物三、分析方法的建立方法的验证特异性标准曲线与定量范围定量下限准确度与精密度稳定性回收率分析过程的质量控制未知样品浓度超出范围的处理相关物质测定其它方法验证四、体内样品分析方法与方法验证（一)、特异性所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。CompanyLogo(二)、