DNA的生物合成-复旦大学生物化学PPT课件

DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication第十章复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA目录•子链继承母链遗传信息的几种可能方式全保留式半保留式混合式•密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。•半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、双向复制复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、复制的半不连续性3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)•顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。•另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。•领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication第二节•参与DNA复制的物质底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi目录•聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´•35外切酶活性•53外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。•核酸外切酶活性目录（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶可能不可能可能基因突变后的致死性无无有5→3核酸外切酶活性20？400分子数/细胞多亚基不对称二聚体？单肽链组成250120109分子量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI可能不可能可能基因突变后的致死性无无有5→3核酸外切酶活性20？400分子数/细胞多亚基不对称二聚体？单肽链组成250120109分子量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-polⅡ（120kD）•DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。•它参与DNA损伤的应急状态修复。功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-polⅢ(250kD)（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol三、复制保真性的酶学依据•复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。•复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质E.Coli基因图•解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链•引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶•单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)解链过程中正超螺旋的形成目录•拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ•分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。•作用机制目录五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。•DNA连接酶(DNAligase)作用方式POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录•DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。•在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。•也是基因工程的重要工具酶之一。•功能DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列53531.DNA解链DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB35352.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录领头链的合成目录随从链的合成目录目录阶段一阶段二阶段三阶段四复制过程简图目录复制过程动画•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶•随从链上不连续性片段的连接目录哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长•染色体DNA呈线状，复制在末端停止。•复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。•染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止53355335+5333355目录目录切除引物的两种机制目录•端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…•端粒酶(telomerase)•端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,