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怎样用好高效液相色谱福立分析仪器有限公司液相色谱仪的使用流动相及储液器1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂.2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相3.改变流动相时防止交叉污染.4.不要使用陈旧的流动相.5.定期更换流动相储液瓶.6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.7.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.液相色谱仪的使用对流动相的要求由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。液相色谱仪的使用对流动相的要求（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.液相色谱仪的使用常用流动相的紫外截止波长液相色谱仪的使用常用流动相的强度参数液相色谱仪的使用•设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更细的水性滤膜和有机滤膜•过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤•过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。必须做!溶剂和水的前处理：过滤液相色谱仪的使用•设备和材料：超声波清洗机•脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡•气泡对测定的影响：1）柱流量不准2）检测器基线波动•脱气注意点：1）每天脱气(无在线脱气器时）2）混合溶剂脱气时间不能过长必须做!溶剂和水的前处理：脱气液相色谱仪的使用•自动进样器•手动进样器原理：六通阀注入方式：1）全量注入2）部分注入进样器样品装填状态(LOAD)手动进样器原理图142356注射口接输液泵接色谱柱多余样品排放142356接输液泵接色谱柱注射状态(INJECT)液相色谱仪的使用•分析结果重现性好•提高柱效•降低柱压•保证检测稳定性柱温控制的优点：使用柱温箱液相色谱仪的使用高压输液泵1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。2.使用HPLC级的流动相试剂.3.使用不锈钢烧结吸液滤头.4.用纯水或双蒸蒸馏水，流量3～5ml/分，冲洗15分钟，冲洗时必须打开排放阀（逆时针拧松）必须做!使用输液泵的注意事项液相色谱仪的使用高压进样阀必须做!每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐.防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子.冲洗方法见进样阀说明书.严禁用!严禁使用气相色谱那样的尖头针进样.根据情况定在注射针前加装针式过滤器,防止样品中的微粒进入进样阀.液相色谱仪的使用液相色谱柱1.流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强.2.避免样品微粒在柱头沉积.3.防止过高压力冲击色谱柱.4.流动相pH大于7时要使用保护柱.5.正确制备样品,在样品注射器前加装针式过滤器.6.色谱柱不用卸下前:a.必须洗去缓冲液.b.防止产生微生物c.用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱.d.柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封.液相色谱仪的使用紫外检测器每次做1.流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗.2.使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内.经常做3.不定期的用强溶剂反向冲洗流过池(拆开柱子).4.不定期的使用空流过池校正波长.根据情况定5.在流过池出口加装背压阀.液相色谱仪的使用操作极限预防1.严禁在无流动相时启动高压输液泵.2.设定泵的上限压力(≤25Mpa)防止长期压力过高损坏泵和进样阀.3.设定泵的下限压力(0.5～1Mpa)防止流动相抽干和严重泄漏.液相色谱仪的使用整台液相色谱仪的维护1.在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。2.关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系统，时间为15～20分钟，流量1ml/分。本步骤主要是冲洗干净系统内其他含盐的部位。3.用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。本步骤主要是保护色谱柱。4.如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。每次用过仪器后必须做!液相色谱分析液相色谱压力计算222/1200/250ppcdLFddLFP（0.46内径柱）式中L――柱长η――流动相粘度F――流速，mL/mindc――柱内径，cmdp――柱填料直径，um反相色谱常用流动相的粘度值（mPa·s）（25℃）有机溶剂/水（体积比）甲醇乙腈四氢呋喃0/1000.890.890.8920/801.40.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46下表红线框内的数字即为该溶液与水混合后的粘度（在25℃时）即η液相色谱分析液相色谱的保留保留时间tR的初步估计：保留时间tR＝死时间t0(1+峰容量因子k’）峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0t0≈0.5Ld2左式中：t0－进样峰的出峰时间tR=t0(1+k’)tR－峰的保留时间L－柱长k’=(tR-t0)/t0d－柱内径k’－峰的容量因子液相色谱分析反相色谱不同配比流动相与容量因子值甲醇/水乙腈/水四氢呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01液相色谱分析溶剂强度改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增加甲醇的比例，流动相变强。正相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇。流动相中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要增加2～3倍。液相色谱分析峰位的重排在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排：（1）流动相中换了强溶剂；（2）pH值的改变；（3）柱填料的改变；（4）柱温的改变；（5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）液相色谱分析溶剂种类a溶剂极性K’如何控制分辨率柱塔板数N原始分离状态改变K’后改变a后改变N后液相色谱分析液相色谱分析方法的建立建立液相色谱分析方法通常有以下几步：（1）选择合适的液相色谱方法（正相或反相）；（2）选择合适的色谱柱；（3）选择合适的K’值的条件；（4）选择良好的峰位（a值）；（5）选择良好的色谱柱条件（N值）；（6）用实测样品解决出现的特殊问题；（7）证实方法的正确性。方法样品特点/色谱柱何时应用该方法反相HPLC流动相：水/有机溶剂色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。离子对HPLC流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂）色谱柱：C18（ODS），C8，氰基离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC硅胶最好液相色谱分析选择液相色谱的方法主要液相色谱方法特性方法描述/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法流动相：水相，另以缓冲物控制pH色谱柱：阳离子或阴离子交换分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择体积排阻色谱法流动相：水相（GFC）或有机相（GPC）色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布疏水作用色谱法流动相：盐溶液色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多用于分离蛋白质液相色谱分析选择液相色谱的方法次要液相色谱方法特性液相色谱分析实验室常备的流动相和固定相为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相（1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷，这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。（2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。几点注意事项色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。液相色谱仪使用中的问题A.不进样时柱压连续升高+流动相有颗粒+流动相溶解性+流动相的不稳定性(聚合)+形成柱死体积(与使用条件有关)B.进样时压力升高+样品有颗粒+样品在流动相中不溶+样品组分与固定相不兼容压力问题液相色谱仪使用中的问题A.所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物）-键合相流失-流动相不稳定(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)B.所有峰都向高保留值方向漂移-在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少-柱改变(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)C.离子型化合物的色谱峰的保留值漂移-流动相中挥发性组分损失(离子强度,pH漂移)-柱改变(键合相或污染)保留值漂移液相色谱仪使用中的问题A.与流动相有关的问题#使用新鲜的流动相B.与色谱柱有关的问题#测试新柱#用标准的测试混合样测试新柱#“清洗”色谱柱后再测#考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响保留值漂移液相色谱仪使用中的问题预柱与保护柱从泵来的流动相预柱进样器保护柱分析柱到检测器预柱对流动相而言保护柱对色谱柱而言液相色谱仪使用中的问题良好的柱使用规范•在使用前过滤溶剂•完全润湿在运输中变干的色谱柱•了解溶剂对样品的溶解性及对分离的影响•对含有保留性较强的杂质组份的样品进行预处理•注意柱子的pH使用范围•定期用强极性的溶剂清洗色谱柱•储存色谱柱时要冲尽缓冲液,并用有机溶剂饱和柱子•避免外力损伤色谱柱,如弯曲、跌落等液相色谱仪使用中的问题使用保护柱带整体过滤片的Techtron保护柱液相色谱柱维护色谱柱压力升高原因1：溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）原因2：样品中的不溶物—应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）原因3：泵，进样器等中的不溶物—在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器原因4：柱内不溶物的形成4-1．由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱4-2．在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀—检查样品液和流动相是否互溶4-3．由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀—将色谱柱密封紧，并保持室温恒定液相色谱柱维护操作压力上升故障排除HPLC系统流程图：吸入过滤器泵内置过滤器外置过滤器进样器保护柱主分析柱检测器和排放系统从流程图的末端依次断开部件，如从检测器开始断开，最容易引起阻塞的部件是：外置过滤器，保护柱和主分析柱[注]：应记录新柱子在常规分析条件