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蒸发光散射检测器（ELSD）应用心得陆小冬Email：lxdongzi2003@sohu.comELSD应用心得自2001年六月开始使用ELSD起，至今已有近五年的时间了；现将这五年来的经验与教训总结归类，来与大家一起分享。这几年我主要是用的法国Eurosep公司的DDL31型ELSD。ELSD应用心得一．样品部分二．HPLC部分三．ELSD仪器部分四．结果处理部分五．仪器故障诊断六．ELSD的优点与缺陷一、样品部分样品的特性之一：挥发性样品的基本结构样品的预处理样品的溶剂样品的上样量一、样品部分（挥发性）1.样品的挥发性是ELSD要考虑的重点问题。2.对于挥发性的或半挥发性的检品（如脂类），最好使用部分检品进入检测池类型ELSD（也称：气溶胶分流型），这样可以使用较低蒸发温度，降低检品自身的挥发。3.对于非挥发性的检品（如氨基酸），最好使用全部检品进入检测池类型ELSD（也称：非气溶胶分流型），这样可以增加蒸发后颗粒数目，从而提高灵敏度。一、样品部分（基本结构）1.在同一类型的检品（如PEG5000与20000）中，高分子量，需要高温度蒸发，才能得到好的信号响应。2.而特别是在低浓度时（与样品尺寸大小相关），分子量的大小决定信号响应因子。3.对于结构类似、分子量差异不大的不同物质，其信号响应因子基本相同（这就是响应因子一致性），这就决定了ELSD可以定量计算未知样品的含量。一、样品部分（预处理1）1.如果样品无需预处理，可以直接上样或溶解后直接分析的，就用流动相去溶解或稀释。2.一般的样品均需要预处理，如果需要萃取时，要注意萃取液中不挥发性物质在最终色谱分析中的干扰；最好让干扰远离检品峰，以便定性或定量。一、样品处理部分（预处理2）3.由于选择ELSD作为检测器，是用于痕量分析中，多数时需要对样品或预处理中的萃取液进行浓缩，这时需要考虑溶液中痕量干扰物。如塑料制品中的增塑剂，在多数萃取时使用氯仿类的萃取液时，会溶解增塑剂，如果直接上色谱分析时，ELSD不会明显显现，一旦进行浓缩后，会把不到1ppm的增塑剂变成10ppm，甚至更大，可以被ELSD检出。一、样品部分（溶剂）1.样品溶剂的沸点希望较低，这样有利于ELSD的使用。2.样品溶剂符合一般HPLC分析要求即可。3.尽可能用分析启始流动相去溶解或稀释样品。一、样品部分（上样量）1.样品上样量主要与所要分析的等级有关，够用最重要，至于是否达到100ppm级还是1ppm，不重要，重要的是否可以用于定性分析或定量计算。2.少量样品时，信号响应因子主要与液滴尺寸大小相关；大量样品时，信号响应因子主要与液滴中的溶质浓度相关；这只会影响标准曲线方程的形式，不会影响计算。二、HPLC部分流动相泵色谱柱柱外效应流速二、HPLC部分（流动相）1.基本要求：挥发性为比样品大。2.常用的试剂，有易挥发的有机溶剂、挥发性酸（硝酸、盐酸、碳酸、甲酸、乙酸或三氟乙酸）、挥发性碱（氨水、三乙胺或乙二胺）、可降解挥发的盐（如碳酸氢铵等）、少量的水。3.不挥发性盐不易用于ELSD；但并不是完全不能用，只是在使用时会损失灵敏度（由于噪音基线的增加所引起的必然结果）。二、HPLC部分（流动相）4.试剂纯度：除要求符合HPLC分析外，还要求含尽可能低的不挥发杂质，特别是水中的有机物杂质。5.如果流动相组成沸点较高，那就需要较高的蒸发温度，才能达到较好的基线。二、HPLC部分（流动相）6.可以使用梯度分析；在用梯度分析时，调整必要的参数，可以使基线改变不敏感。7.改变流动相组成将会改变信号响应因子：特别是在梯度分析样品时，要预先将各个不同比例的流动相的基线调成一致，（一般是通过蒸发温度来控制的）。二、HPLC部分（流动相）8.我曾用过的作为流动相的溶剂：正相色谱中，氯仿/甲醇/二氯甲烷/正己烷/异丙醇为主，添加一定量的水、氨水、三乙胺、乙二胺、乙酸；反相色谱中，乙腈/甲醇/二氯甲烷/水为主，添加一定量的三氟乙酸、硝酸、甲酸；凝胶色谱中，乙醇/水为主，添加一定量的碳酸氢铵、碳酸铵；离子色谱中，水为主，添加一定量的碳酸氢铵、碳酸铵，少量的Tris盐。二、HPLC部分（泵）1.最好采用低脉冲输液泵。2.采用多元流动相时尤其注意梯度比例阀的精度和重现性。3.如果能用高压梯度泵，效果会更好。4.由于用ELSD作为检测器时，多用有机溶剂，在更换流动相时，一定要注意流动相之间的互溶性问题。（如乙腈与正己烷是不互溶的。）二、HPLC部分（色谱柱）1.通用的HPLC色谱柱均可以使用。2.如果采用微径柱，可以提高信噪比。3.由于流动相选择的局限性，可以在选择色谱柱时加以弥补。4.在使用反相等键合柱时，特别要注意防止键合相的脱落引起的鬼峰。5.在使用硅胶柱时，同样要注意防止硅胶的流失，从而带来鬼峰。二、HPLC部分（柱外效应）1.从色谱柱到ELSD之间尽可能用微径管路，以降低柱外效应。2.要注意室温的变化，特别是不同天之间的变化。3.在使用柱温与室温相距较大时，要尽可能降低柱后管路长度。二、HPLC部分（流速）1.通常用的HPLC流速均可以使用。2.对于低流速，如毛细管色谱中的应用，需要改进一般的ELSD，可以满足分析的应用。3.高流速，会降低雾化时的液滴尺寸大小，从而会降低信号响应。4.必要时可以采用变流速分析，同样也能得到很好的基线。三、ELSD仪器仪器联接位置气源温度控制光源分流模式尾气仪器清洗三、ELSD仪器（联接位置）1.由于ELSD属于样品破坏型检测器，其在仪器联接过程中位于末段。2.可以串联与紫外、视差、荧光、多角度激光等非破坏性检测器之后。3.如果要联接两个都是破坏性检测器，需要有柱后分流装置。4.ELSD不太适用于生产过程中。三、ELSD仪器（气源）1.首选氮气，但有时空气也行，主要考虑流动相的组成；如果是易燃易爆组分，应避免使用空气，以免发生危险。2.气体要求干燥、无尘，气流一定要稳定。3.可以使用气泵或压缩气体罐。4.气体流量和压力最好可控，这样可以优化检测方法，从而得到更好的结果。三、ELSD仪器（气源）5.气体流速的增加，会降低雾化时的液滴尺寸大小，从而降低信号响应。6.气体流速的增加，理论上会提高检品到达检测池的时间，从而降低保留时间，增加信噪比。7.一般来说，样品从进入ELSD到被检出，所需时间都很短，如6秒左右；如果增加气流速度一倍，并不能把时间降到3秒左右，所以要得到好的结果，需要实际测定才能优化气流流量。三、ELSD仪器（温度控制）1.温度的稳定性是最重要的。2.在选型时，最好选择从雾化开始到尾气部分均能稳定控温的为佳（即：全程控温为佳），这样可以保证ELSD内部气体流的稳定。3.一般来说，高的蒸发温度会降低蒸发后的颗粒尺寸大小，从而降低信号响应。4.在调整温度大小时，先从大的范围开始，如40℃到120℃，每10℃一步；再在理想的范围内以每2或1℃一步。三、ELSD仪器（光源）1.在仪器选型时，最好选择激光光源或电子管发光的类型，以保证在使用寿命内光源能量稳定。2.在使用卤素灯作为光源时，如果发现信噪比下降很多，就说明灯的能量已经下降很多了，改换灯了。3.对于光源的更换，如果有充裕的资金，建议让厂家来更换；当然自己更换省钱。三、ELSD仪器（光源）4.通常需要更换的光源是卤素灯，如果想更省钱省时间，可以换国产灯泡，几元一个，大约能用到400多小时。5.卤素灯在更换时，最好戴一次性塑料手套操作，必要时先用甲苯、再用丙酮清洗灯泡外表面；对于国产灯泡最重要。6.一般灯泡的位置有要求，更换后要保证发光点（主发光灯丝）的位置正好在透镜处。三、ELSD仪器（光源）7.更换后的光源一定保证其稳定（无震动），这样才能保证进入检测池的光源自身的稳定性。8.如果仪器自身可以自由控制光源的开关，应尽可能少开光源；但更忌讳频繁开关电源，那样对于卤素光源、激光光源或电子管光源都会有很大损失的。三、ELSD仪器（分流模式）1.ELSD仪器的蒸发管的结构不同出现了不同的分流模式，当初就是针对不同样品而出现的。2.仪器的分流模式，在使用时来说，是无法选择的，因为在购买时就已经确定了。3.对于易挥发的检品（如脂类），最好使用部分检品进入检测池类型ELSD。4.对于本身不易挥发的检品（如氨基酸），最好使用全部检品进入检测池类型ELSD。三、ELSD仪器（尾气）1.在ELSD选型和位置放置时，一定要考虑尾气的排放问题。2.由于较多的使用有机溶剂，而多数是有毒害作用的；加上ELSD要把流动相中有机溶剂挥发成气体才能工作，就必须要考虑尾气的问题。3.如果有统一回收净化处理的装置是最好的，否则一定要把尾气导入通风橱中排出工作室。三、ELSD仪器（仪器清洗）1.一般清洗是指对雾化区、蒸发管及检测池的清洁保养工作。2.一般ELSD仪器说明书都会告诉你如何清洗。3.在清洗前要认真考虑好你将要做的工作会有什么意外：仪器的污染主要是什么（你最常用什么流动相和样品）？是否会腐蚀系统的密封部件？是否会对HPLC有腐蚀？是否会带来新的污染？四、结果处理做分析是要给出一个结论性的答案的。需要考虑灵敏度、检测限、定量限、定量范围（如线性范围）、精密度及重复性。一类物质的响应因子具有一致性，所以可以用一个物质来代替一类物质，应用于定量计算中。四、结果处理（检测限）1.检测限：通常取信噪比为3，即以噪声的3倍作为最小可检测的信号。2.检品在ELSD中的检测限并不固定不变，它可随着实验条件的改变而变化，某些检品在条件合适时，检测限可以达到10ng。四、结果处理（定量限）1.定量限：通常取信噪比为10，即以噪声的10倍作为最小可准确定量的信号。2.由于应用ELSD时，多数是在其它方法定量限太大时才选择的，所以一般的定量范围就是从这里开始的。3.在合适的条件下，可以达到500ng。四、结果处理（定量范围）1.理论上ELSD响应值与检品质量的关系：I＝kmb取对数：lgI＝blgm＋lgk其中：m：待测组分的质量I：待测组分所产生的响应值k，b：常数四、结果处理（定量范围）2.定量曲线不过零点。3.在较高浓度范围，ELSD的检品质量与响应值的曲线为线形的。4.在低浓度范围，ELSD的检品质量与响应值的曲线为非线形的。5.非线形曲线方程有用对数曲线的、也有用多项式曲线的。6.具体用何种曲线方程现无定论。四、结果处理（定量范围）6.由于ELSD响应曲线的不确定性，在多点校准中究竟是采用直线模型还是非线性模型，以及采用何种非线性模式，一直都是HPLC-ELSD定量计算中最受争议的地方。四、结果处理（灵敏度）1.灵敏度是指测量响应除以对应的输入量变化。2.灵敏度实际上就是响应值-浓度（或样品量）关系作出的直线的斜率，斜率越大则灵敏度越高。3.在上面的公式中，理论上b值一般在1.0至1.8之间。四、结果处理（精密度）1.在常规实验中，以进样精密度反映出来的ELSD稳定性，通常RSD3%。2.ELSD重现性能够有效保证。3.ELSD可以满足一般定量要求。四、结果处理（定量计算）1.单点校准2.多点校准法3.随行标准曲线四、结果处理（单点校准法）单点校准法，是目前普遍采用的色谱定量方法。是基于物质量与响应成正比例，即响应直线经过原点，当对照品与样品响应值接近时，利用二者的响应值与对照品的含量计算供试品含量的一种简化方法。ELSD线性方程不过原点，响应值与物质量不成正比例关系。故不宜用该方法进行定量计算。四、结果处理（多点校准法）使用一组浓度梯度标准样，或同一浓度下一组上样体积梯度，通过实验得到的一条标准曲线，用来计算未知样品中组分含量的方法。在有标准品，并且时间充裕的情况下，是一个非常不错的计算方法。缺点是费事、费试剂（钱）。四、结果处理（随行标准曲线）1.在仪器分析中，如果输入值与响应值之间的关系牢固不变，可以将校准值在较长时间内加以引用，而无需在每次测量时对仪器进行实时校准。2.对色谱分析而言，视各种影响因素而定，一般均在样品测定过程中采用单点或多点对照品随行实验，以消除一些影响因素，提高测量结果的重现