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食品中苏丹红I的免疫学快速检测方法研究fuyunjie1985@163.com前言苏丹红I（1-苯基偶氮-2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。苏丹红I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和1-氨基-2-萘酚，这些物质会攻击肝细胞，引起中毒性肝病，也可造成神经系统损害，是一种遗传毒性致癌物。苏丹红I前言-苏丹红I检测现状目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器（HPLC、IAS-HPLC）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于：1.检测仪器昂贵2.检测成本高3.操作复杂4.耗时长5.需专业人员操作6.不适宜现场抽查及推广应用免疫学检测技术解决食品中苏丹红I快速检测的问题！一.研究内容苏丹红I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法1.苏丹红I多克隆抗体的制备苏丹红I多克隆抗体的纯化及含量测定苏丹红I多克隆抗体的制备苏丹红I衍生物-明胶免疫抗原的合成苏丹红I多抗制备免疫原的制备：①利用重氮法合成带有羧基的苏丹红I衍生物②利用混合酸酐法合成苏丹红I-明胶复合物对氨基苯甲酸2-萘酚苏丹红I衍生物苏丹红I衍生物明胶苏丹红I衍生物-明胶1.1苏丹红I免疫原的制备首次免疫：0.5mL完全弗氏佐剂+0.5mL2mg/mL免疫原,于兔背部注射。2周后:0.5mL不完全弗氏佐剂+0.5mL2mg/mL免疫原，足掌注射。每隔10天:于兔耳缘静脉注射免疫抗原1.0mL，加强免疫3次。最后一次免疫后的7～10天试血。2.3苏丹红I多抗的制备选择体重2kg的雄性新西兰兔，按照常规免疫程序，制备多克隆抗体。整个免疫过程为2～3个月。2.4多克隆抗体的纯化辛酸硫酸铵法亲和层析法2.1苏丹红I衍生物的合成结果苏丹红I衍生物红外图谱鉴定a-苏丹红Ib-衍生物b曲线在1700cm-1处存在较强的吸收峰表明反应产物的结构上基本连接羰基。2.2苏丹红I衍生物的色谱分析结果2.3苏丹红I免疫原的合成结果a曲线显示苏丹红I在500nm处有强的特征吸收峰；b曲线显示明胶在220nm处有强的特征吸收峰；c曲线同时具有苏丹红I和明胶的特征，表明苏丹红I与明胶偶联成功。苏丹红I免疫原紫外扫描结果2.4SDS-PAGE测定IgG的纯度M-低分子量Maker；1-苏丹红I抗血清；2-AC纯化抗体；3-CA-AS纯化。1.苏丹红I抗血清，有多条带，含有较多杂蛋白；2.经CA-AS纯化后，有3-4条较明显的条带，血清经纯化后，大部分杂蛋白被除去；3.经AC纯化后，有两条明显条带，一条为重链，分子量约55KD，另一条为轻链，分子量约14KD，与IgG抗体的重链和轻链的分子量较符合，纯化后的抗体纯度较高。2.5特异性IgG的浓度测定y=0.5198x+0.2464R2=0.977800.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.6蛋白质浓度(mg/mL)A(592nm)根据BCA法的标准曲线y=0.5198x+0.2464，R2=0.9778，计算得到:辛酸硫酸铵纯化的抗体浓度为4.24mg/mL，亲和层析柱纯化的抗体浓度为1.93mg/mL。BCA法测定蛋白质浓度一.研究内容苏丹红I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法2.1间接竞争ELISA方法的建立1.苏丹红I抗体效价的测定研究内容3.建立间接竞争ELISA检测方法2.苏丹红I抗体亲和力的测定4.待测样品的前处理2.1.1苏丹红I抗体效价的测定00.20.40.60.811.26432168421抗体稀释度(×1000-1)吸光度值（A492nm）抗苏丹红I特异性抗体效价测定效价为1:320002.1.2苏丹红I抗体亲和力的测定本实验利用竞争ELISA法，测定抗体的亲和力。若抗体具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即可产生50%的抑制率，故常用IC50，即产生50%抑制率时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性，以10%抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限。抑制率=100%-(OD1-OD阴性)/（OD2-OD阴性）×100%，其中，OD1为竞争孔的OD值，OD2为不含苏丹红I孔的OD值。0102030405060708090100123456苏丹红I的浓度对数lg(ng/mL)B/B0(%)抗血清亲和性IC50：15.0ng/mL，最低检测限IC10：1.0ng/mL。2.1.3间接竞争ELISA的建立酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，显色程度与样品中苏丹红I含量成反比。00.20.40.60.811.21.41.6050100150200250300苏丹红I标准抗原浓度（ng/mL）OD492nm根据待测样品的OD值，推算出样品中的苏丹红I的浓度。2.1.4待测样品的处理实际添加量(μg/kg)ELISA检测量(μg/kg)加标回收率（%）变异系数(n=3)/(%)4.003.8195.256.68.006.8785.884.916.0015.6597.837.432.030.5695.506.2称取2.0g的空白辣椒粉样品，准确加入10mL乙腈，均质2min，超声15min。滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水，所得溶液用真空旋转蒸发仪40℃旋转蒸干，甲醇-0.02mol/LPBS0.2mL溶解残渣。实验结果测得辣椒粉中苏丹红I的加标回收率为85.88%-97.83%2.1.5交叉反应率测定用建立的间接竞争ELISA法测定苏丹红其他染料，计算苏丹红I抗体的交叉反应率。结果表明该方法与苏丹红II、苏丹红III和苏丹红IV的交叉反应率分别为2.7%、6.5%和4.1%，仅有较低的交叉反应性，说明该方法的特异性良好。二.免疫学检测方法的建立检测方法的建立苏丹红I的胶体金免疫层析方法苏丹红I的间接竞争ELISA法2.1金免疫层析技术概述胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一项新型体外快速诊断技术，该技术发展迅速，已在食品安全、医学检测、农药畜牧、生物反恐等多应用领域中得到了广泛发展。本研究应用竞争抑制免疫层析的原理，样品中的苏丹红I在流动的过程中与金标苏丹红I抗原，竞争结合NC膜检测线上苏丹红I多克隆抗体。通过检测线T是否显色判断结果。2.2金免疫层析试纸工作原理强阴性阴性怀疑阳性2.2胶体金免疫层析试纸法的建立1.胶体金溶液的制备研究内容3.免疫层析试纸的制备2.金标抗原的制备4.试纸条的检测2.2.3胶体金溶液的制备胶体金的制备多采用还原法。本研究利用柠檬酸三钠还原法制备24.5nm的胶体金。2.3.4金标记抗原的制备1.用0.2mol/L的K2CO3调节金溶胶至pH9.0；2.将苏丹红I抗原与胶体金结合，搅拌15min；3.加入PEG20000，静止2h。低速离心25min；4.取上清，高速离心50min，弃上清；5.用稀释液将沉淀恢复至原体积，高速离心50min；6.将沉淀（金标抗体）恢复至原体积的1/10。1.硝酸纤维素膜的选择条件优化3.金标抗原喷涂量的选择2.NC膜上抗体浓度的选择2.3.4免疫金试纸条的制备①0.45μm孔径的NC膜②C线浓度：0.6mg/mL③T线浓度：0.6mg/mL④5uL/4×4(mm)优化结果2.3.5胶体金免疫层析试纸的测试配制标准浓度的待测液，使得苏丹红I的浓度分别为0,5,10,15,20μg/kg。取90uL滴加在试纸的样品区，10min后观察结果。结果判断：若C、T亮度基本一致，表示阴性结果；若C线亮度明显亮于T线，表示阳性结果；若均未出现C、T两线，表示该试纸无效。2.3.6试纸条测试结果y=-4.5291x+95.055R2=0.968502040608010005101520苏丹红I的浓度（μg/kg）结合比（%）苏丹红I浓度达10ug/kg时，检测线T的颜色明显变淡，即试纸条的检测限为10μg/kg。各重复数值的变异系数≤9.23%。05101520浓度/(μg/kg)2.3.7实际样品测定从市面上随机购买两种辣椒粉样品，分别进行试纸条和HPLC实验测定，验证试纸方法的准确性。A为苏丹红I标准品，检测波长为476nm。B1、B2为辣椒粉样品的试纸条检测结果:B1为阴性，B2为阳性；C1、C2为HPLC的检测结果:B1：6.663μg/kg，B2：12.165μg/kg。两种检测方法的结果一致，免疫层析试纸条测试结果具有一定可靠性。2.3.8ELISA、ICstrip、HPLC三种方法的比较为了验证两种方法的准确性，将检测结果同HPLC法进行比较。结果表明，这3种方法测定的结果具有高度相关性。测定结果为3次测试的平均值，变异系数≤10.7%。检测方法苏丹红I的实际添加浓度/(μg/kg)4.008.0016.0032.00HPLC3.937.8215.9131.89ELISA3.816.8715.6530.56试纸条阴性阴性阳性阳性表1三种检测方法的比较三、研究的技术特点及创新点分析1.本研究将免疫学方法应用于食品中苏丹红I的快速检测，简单快速、准确可靠，解决了仪器检测中存在的问题。2.苏丹红I免疫层析试纸法，国内外文献查新结果证实，本方法为首次提出，并获得专利。研究初期，ELISA方法也无其他文献报道。本成果具有一定的创新性和先进性，并具有自主知识产权。谢谢大家！