菌种来源

第二节菌种来源Chapter1continued微生物工程工业生产水平的三个决定要素:生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节.一、菌种分离与筛选工作程序发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定调查研究（包括资料查阅）试验方案设计采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离增殖条件探索根据实际情况进行定量或半定量测定第一次原种斜面第二次原种斜面初筛（1株1瓶）定量或半定量测定筛选工作程序第三次平板分离第三次原种斜面复筛第四次平板分离不纯第四次原种斜面再复筛种子培养初步工艺条件摸索较优菌株1株3-5瓶保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏二、分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料2、菌的生长温度3、菌的稳定性4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株三、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样杨尺蠖赤松毛虫侧柏毛虫四、含微生物样品的富集培养富集(enrichment)培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。五、利用固体平板的生化反应进行分离（方法之一）利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。可显著提高分离效率透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法1、透明圈法分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈如何分离磷细菌？聚赖氨酸产生菌（带正电、加美兰、排斥呈现透明圈）透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。如筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如分离解脂微生物豆油作底物中性红（红～黄.6.8～8.0.）指示菌落周围呈红色圈3、生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌4、抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈六、随机分离方法有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处，因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素。2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如NH4+），它们可能引起分解代谢阻遏。4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+）5）加入缓冲液以减少pH变化七、一些生物活性物质产生菌的分离抗生素抗肿瘤药物酶抑制剂生长因子等等1、抗生素产生菌的分离抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术如棒酸（clavulanicacid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用2、抗肿瘤药物产生菌的分离临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质大部分具有抗菌或抗真菌的活性现发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法生化诱导分析法（Biologicalinductionanalysis;BIA）将E.colilacZ连接在噬菌体的PL启动子下当DNA损伤时，诱发阻遏蛋白CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，表达出-半乳糖苷酶测定-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在X-Gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside;5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）作显色底物；反应后呈蓝色3、酶抑制剂产生菌的分离某些酶与病理相关如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶靶区靶酶抗高血压血管紧张素转移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症缩合酶抗组氨组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶4、生长因子产生菌的分离通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产生菌生长的培养基上Uv照射杀死菌落铺上一层含相应生长因子缺陷型菌株第三节菌种选育菌种选育应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种（详后）一、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自发突变(spontaneousmutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。二、诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。一）诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备活细胞计数诱变剂处理活细胞计数中间培养突变株分离初筛复筛生产性能试验诱变预备处理诱变育种的工作程序1、出发菌株的选择选择时注意以下几点：1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。2、单细胞（或单孢子）悬液制备一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂2）可避免长出不纯的菌落。处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态细胞菌龄一般在对数期，霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高。同步化前培养的具体做法：接种培养24h的斜面入50ml基本培养基中，37ºC振荡培养16h，然后在6ºC放置1h，以得到同步生长和分裂。将菌体离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，37ºC振荡培养30-50min。立即降至2ºC保藏10min，再离心洗涤两次，悬浮于冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，制备成菌悬液，供处理用。3、诱变剂及使用剂量的选择凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波等硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等诱变剂物理诱变剂化学诱变剂紫外线(Uv)使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广对诱变最有效的波长是260nm左右(253-265nm)作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡.快中子中子是不带电荷的粒子