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菌种的保藏组长：叶慧沁组员：许重望、叶小冬叶智琼、叶妍悦菌种保藏的意义•菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。概念•标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。•标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。•商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株保藏的标准储备菌株制备的工作菌株•菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。•菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。菌种衰退的原因•1、菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。•2、表型延迟现象也会造成菌种衰退。•3、质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。•4、连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。•5、不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。如何预防衰退•1、合理的育种•2、选用合适的培养基•3、创造良好的培养条件•4、控制传代次数•5、利用不同类型的细胞进行移种传代•6、采用有效的菌种保藏方法菌种的复壮•菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。•狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；•广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。复壮的方法•1、纯种分离。采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。•2、通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）。主要是对一些寄生性的菌株，可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内，提高其寄生性能及其它性能。•3、淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留下群体中生长健壮的个体.4、4、采用有效的菌种保藏方法。菌种保藏的基本原理•微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。•低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。（二）菌种保藏步骤①挑选特征典型的纯菌菌落；②确定保藏的合适菌体形态；③选择最适宜的保藏方法；④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。1.琼脂斜面低温保存法•（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年~一年。有的甚至更长时间。•（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面各类菌种保藏条件及时间菌种培养基保存温度传种时间细菌一般多用于营养琼脂或根据菌种规定选用培养基4~6℃芽孢杆菌3~6个月，其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6℃一般4~6个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等4~6℃每4个月移植一次（每2个月移植一次）（3）特点：优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。（4）注意事项：•保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。•保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。•必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。•每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。•保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。•铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。2、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1）方法：•将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。•取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。•将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。•适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。液体石蜡对各类菌种保藏效果菌种菌株数保存时间（年）存活率（%）细菌霉菌酵母菌放线菌87586400380552420.983.688.991.3（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。（4）注意事项：①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1㎝为宜。⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。