菌种的复壮与保藏

第二章菌种的退化、复壮与保藏第一节菌种的退化和复壮一、菌种的退化（一）原因菌种保藏不妥菌种生长的条件要求没有得到满足自身突变和自发突变（二）菌种退化的表现生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型。菌落及细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越小；代谢产物生产能力下降；抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。（三）菌种退化的防治从菌种选育方面考虑1)尽量使用孢子或单核菌株2)诱变处理后的菌株应充分的分离纯化，保证获得菌株的纯度。控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。创造良好的培养条件1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失采用有效的菌种保藏方法从菌种管理的措施上考虑菌种复壮二、菌种的复壮侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高。•对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化•淘汰衰退的个体•通过寄主体内进行复壮•改变培养条件•诱变剂处理复壮措施方法第二节菌种的保藏一、理想的菌种保藏方法应具备的条件1经长期保藏后菌种存活健在；2保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。3菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。•世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有28家。Ex：美国的标准菌种保藏所（ATCC）美国农业部农业研究服务部（ARS）英国国立标准菌种保藏所（NCTC）我国：1普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）2农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）3工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）4医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）5抗生素菌种保藏管理中心（CACC）6兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）二、微生物菌种保藏技术•原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温等。•斜面保藏法•穿刺保藏法•沙土管干燥保藏法•真空冷冻保藏法•液氮保藏法•悬滴保藏法•低温保藏法斜面保藏法•接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏•适用：各大类•保藏期：3~6个月•缺点：保存期短，传代多，易退化点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。中央划线：从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。密波状蜿蜒划线法:从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。挖块接种法:挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。斜面接种法培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。保藏：培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。半固体穿刺保藏法•穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏•适用：好气性细菌，酵母等•保藏期：6~12个月用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2~3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌等。砂土管干燥保藏法•措施：无营养，缺氧，干燥•方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→5℃保藏•适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌•保藏期：2~10年或更长河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压间歇灭菌2~3次，烘干备用。沙土管制作沙：•向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。•真空抽去沙土管中水分。•将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。•保藏时间2～10年。无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙土管恢复培养真空冷冻干燥保藏法：措施：低温、干燥，缺氧，保护剂方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25~-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏适用：各大类保藏期：5~10年或更长基本程序•1安瓿管的处理直径8~10mm，长度不小于100mm，洗净高压备用。•2保护剂低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。•3菌悬液制备最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌24~48h，酵母72h，放线菌和丝状真菌7~10d。•4冷冻干燥•5安瓿管的保藏4-5℃保藏复苏方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——将安瓿管顶部烧热，——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。安培瓶冻干机液氮超低温保藏法措施：低温、加保护剂（10%甘油、5%DMSO）方法：菌悬液→加入保护剂→分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-25℃→液氮罐保藏适用：范围广泛•保藏期：一般2～3年，长则9年。菌种的准备可采用下列几种方法：•刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；•接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；•将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；•在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。复苏方法：从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。菌种冻存管悬滴保藏法•措施：无营养，悬浮，溶液•方法：寡营养保藏，放置10℃或室温•适用：丝状真菌、酵母、肠道细菌•保藏期：1年或更长常用的有蒸馏水、0.25MPBS或生理盐水，关键是试管应密封好，以防水分蒸发。低温保藏法•方法：-20℃•适用：无芽孢厌气菌，放线菌等•保藏期：1年或更长注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后在冷藏。三、菌种保藏的注意事项•菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢•菌种保藏所用的基质：碳源•操作过程对细胞结构的损害本章重点内容•菌种退化的现象及防治原则。•菌种保藏的原理是什么？其方法有哪些？分别适合何种菌种的保藏？•真空冷冻干燥保藏法的基本程序。•常用于真空冷冻干燥的保护剂有哪些？常用于液氮保藏法的保护剂有哪些？