细胞生物学的研究技术和方法, 线粒体活体染色与观察

李姣（吴明松）细胞生物学与遗传学教研室2014.11～2014.12TEL：[phone]E-mail:[e-mail]1号综合楼2-25室1.预习；2.穿白大衣并扣好；3.认真操作；4.爱护仪器；5.保持卫生；6.保持安静。实验室规则1#############。2#########。3############。4###################。5#############。6#########7#########实验课要求实验室安全注意事项1.实验完成后检查水电；2.实验动物回收焚烧：填表责任制；3.了解化学试剂毒性和安全使用规则；4.突发情况处理及逃生，如各种原因起火分别用关电闸、盖布、打开门窗、报警，及其他突发情况，依次离开实验室及大楼等。本学期实验教学进度安排第一次(验证性)细胞生物学研究技术和方法线粒体的活体观察第二次(验证性)细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的原位显示细胞内DNA和RNA的原位显示第三次(验证性)细胞膜的通透性观察小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察第四次(验证性)细胞内过氧化物酶的原位显示细胞有丝分裂的观察第五次(设计性)设计性实验报告汇报及指导第六次(设计性)动物细胞融合细胞核的分离与鉴定第一次实验Ⅰ细胞生物学的研究技术和方法Ⅱ线粒体活体染色与观察I细胞生物学的研究技术和方法细胞形态结构研究技术显微观察亚显微观察细胞的培养技术细胞组分的分离纯化技术细胞和亚细胞组分的测定原代培养传代培养分级分离技术层析法电泳法细胞化学法荧光细胞化学法放射自显影技术显微结构microscopicstructure在光学显微镜下所观察到的细胞结构亚微结构submicroscopicstructure细胞内小于0.2μm的细微构造，通常使用各种电子显微镜进行观察细胞形态结构研究技术分辨力（率）resolution显微镜或人眼在25cm的明视距离处能够区分相近两点最小距离的能力。普通光学显微镜lightmicroscope，LM染色后可观察线粒体、中心体、细胞核等结构最大分辨力一般为0.2μm相差显微镜phasecontrastmicroscope观察活细胞的微细结构和变化暗视野显微镜darkfieldmicroscope反差大、分辨力高（0.04μm)观察活细胞内细胞器以及液体介质中的细菌和真菌等的存在和运动荧光显微镜fluorescencemicroscope光源——紫外线细胞荧光化学，特别是免疫荧光技术中的重要工具，可观察细胞或标本中的荧光现象分辨力达0.08nm观察细胞内部结构二维平面图像透射电子显微镜TEM扫描电子显微镜SEM分辨力一般在3nm观察细胞（样本）表面形貌三维立体图像细胞的培养技术细胞培养cellculture细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。原代培养primaryculture直接从机体获取的组织或细胞进行的首次培养。原代细胞以一定比例转移到另一个或几个容器中的扩大培养。传代培养secondaryculture一般传一次称为一代细胞融合cellfusion又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。含有同一亲本细胞核的融合细胞含有不同亲本细胞核的融合细胞同核体homokaryon异核体heterokaryon细胞融合技术自然融合人工诱导融合细胞融合技术是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤等的重要手段，尤其对单克隆抗体及细胞去分化的研究开拓了一条新的途径物理化学生物细胞组分的分离纯化技术细胞组分的分级分离cellfractionation根据细胞内各种结构的比重和大小等不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，用不同介质或不同转速的离心，将细胞内各组分分级分离出来，并进行分析的方法。基本步骤组织匀浆分级分离分析密度梯度离心差速离心用细胞化学法或生物化学的方法分析、鉴定得到的细胞组分差速离心密度梯度离心细胞和亚细胞组分的测定细胞化学法cytochemicalmethod在保持细胞结构的基础上，利用某些化学物质可与细胞内某种成分发生化学反应，在局部范围形成有色沉淀物（或电子密度高的物质）的原理，对细胞的化学成分进行定性、定位和定量的研究。碱性蛋白显示酸性蛋白显示I细胞生物学的研究技术和方法细胞形态结构研究技术显微观察亚显微观察细胞的培养技术细胞组分的分离纯化技术细胞和亚细胞组分的测定原代培养传代培养分级分离技术层析法电泳法细胞化学法荧光细胞化学法放射自显影技术II线粒体活体染色与观察1.了解线粒体的原位分布；2.了解活体染色的原理和方法。一、实验目的二、实验原理线粒体上的细胞色素氧化酶系可保持詹纳斯绿B染料始终处于氧化状态而呈绿色。活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂显示活细胞内某些天然结构，是对细胞生命活动影响较小的一种染色方法。20min实验步骤（点击图片查看详细介绍）取口腔粘膜上皮细胞：用牙签轻轻在口腔颊部内侧粘膜上来回刮取几下即可。注意掌握力度。滴加染液：滴加1～2滴詹纳斯绿B染液于载玻片上的口腔粘膜上皮细胞上。盖盖玻片：用镊子夹住盖玻片的一端，使另一端轻轻接触染液，慢慢沿染液往下放，当盖玻片几乎与载玻片持平时，抽出镊子。注意动作要轻，避免产生气泡。显微镜下观察（镜检）：用低倍镜在视野中寻找目标，用高倍镜进行观察。观察线粒体：细胞质无色，在细胞质中散在一些蓝绿色短杆状和圆形颗粒，即为线粒体。2008级临床K4班学生实验结果1.取材部位及力度；2.盖片的技巧；3.染液干后的处理。四、注意事项1.简述用于细胞的显微和亚显微结构研究的技术及其特点；2.简述细胞培养的概念；3.请描述线粒体活体染色的显微观察结果。五、作业