第十六章色谱法分离原理介绍

第十六章色谱法分离原理第一节概述色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的。1941Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952James和Martin发展了气相色谱；1956VanDeemter提出速率理论；1967Kirkland等研制高效液相色谱法；20世纪80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。1903俄国植物学家茨维特分离植物色素ts在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第二节色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在气固/液固吸附色谱或气液/液液分配色谱的线性范围内，则色谱峰是对称的。（二）基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）（四）保留值1.死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算，即ū=L/tM2.保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。信号进样tR3.调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tRtM由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。V0=tMFco式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。5.保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：VR=tRFco6.调整保留体积VR某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。VR=VRV0=tRFco7.相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tR2/tR1´=VR2/VR1由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即=tR(i)/tR(s)式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。(五)区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为Y1/2=2.3543.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是Y=4从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。（一）分配系数K和分配比k1.分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它（K）是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。2.分配比k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即k=组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量=ns/nmk值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。k=ns/nm=CsVS/CmVm式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比k值可直接从色谱图中测得。k=(tR–tM)/tM=tR/tM=VR/V03.分配系数K与分配比k的关系K=kVS/VM=k.其中β称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6-35；对毛细管柱，其β值为60-600。滞留因子Rs分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以us＜u．此两速度之比称为滞留因子Rs。rmssttuuRRs若用质量分数表示，即对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为knnnnnRmssmms1111sruLtuLtm整理得)1(kttmrmrmrmmrVVtttttk4.分配系数K及分配比k与选择因子α的关系对A、B两组分的选择因子，用下式表示：α=tR(B)/tR(A)=k（A）/k（B）=K（A）/K（B）通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。浓度沿柱移动距离LABABKAKB图中KAKB，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。小结色谱法研究的核心----选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。（二）塔板理论把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/Hn称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0．5，其中气液（或气固）两相各为0．25,而1号板上所含总量同样为0．5．气液（或气固）相亦各为0．25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103-106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2式中tR与Y1/2(Y)应采用同一单位（时间或距离）。从公式可以看出，在tR一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。在实际工作中，由公式n=L/H和n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：n有效=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2有效板高：H有效=L/n有效因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/Y)2=16（400/40）2=1600块塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出