18 ribozyme & DNAzyme

第十三章Ribozyme&DNAzyme第一节ribozyme一ribozyme的发现：•1982Cech发现嗜热四膜虫26sRNA前体（413nt，有2个外显子，中间有一个内含子(或间隔序列，IVS)）在成熟过程中无需酶的催化，但需5’-GMP和Mg2+。这一反应被称为自我剪切反应，是在26sRNA前体的IVS催化下完成的。•1983Atlman发现tRNA成熟酶(RNA酶P)的RNA具有催化功能。Pr：119aaRNA酶PRNA：377nt，在[Mg2+]20mmol/L时具有全酶的功能。•为了证明RNA中无蛋白所做的工作：①把分离出的RNA制剂用含SDS的苯酚抽提②用蛋白酶处理③催化反应在0.1%的SDS溶液中进行④通过体外重组合成的RNA同样具有催化功能•1989年，SidneyAltman和ThomasCech共同获得Nobel化学奖•注意：真核生物RNAaseP中的RNA没有催化活性二ribozyme的类型及作用机制(一)自我剪接型（selfsplicing):1.Ⅰ型:催化需5’-GMP和Mg2+参加•代表：来自四膜虫26SrRNA前体L19-IVS•催化机制：5’-GMP3’5’OHG5’3’(G-IVS)G+Mg2+Mg2+L19-IVS(395nt)5’3’•L19-IVS是一个多功能催化剂:①转核苷酸作用：2(Cp)4C(Cp)5C+(Cp)3C②水解作用：(Cp)4C(Cp)3C+pC③转磷酸作用：(Cp)6+UpCpU(Cp)5C+UpCpUp④去磷酸作用：(Cp)5C(Cp)4C+Pi⑤RNA限制性内切酶功能:-CpUpCpUpN-+G-CpUpCpU+GpN-•特点:①高度底物专一性：与底物的识别是通过碱基配对方式L19-IVS对polyC6专一性比polyU6专一性高，对polyA6和polyG6不作用——活性中心是富含G的片断:5’-GGAGGG-3’②属于I型的核酶都有着十分相似的二、三级核心结构③服从米氏动力学对竞争性抑制剂敏感2.II型ribozyme：•II型ribozyme在催化剪接反应时不需要鸟苷酸，但需要Mg2+•催化机制：5’3’3’A2’-OHMg2+5’OH3’A2’-OH3’5’3’+A2’-OH3’OH（二）自我剪切型（selfcleavage)：•自我剪切型：只有剪切，没有连接过程。•代表：RNaseP的M1RNA；噬菌体RNA前体等•催化特点：形成特定的二、三级结构：1.锤头结构（hammerheadstructured)：从GUX的3’-端断开ribozymeRNA底物5’3’5’3’(1)GUX3’端5’3’5’3’(3)(2)GUX3’端5’3’5’3’GUX3’端5’3’5’3’3’5’(4)•锤头型核酶一般呈球状。最少只需要11~13nt的RNA2.发夹结构（hairpinstucture):•剪切模式中含有GUC序列的RNA都可作为底物。•机制：底物RNA与ribozyme形成类似发夹的结构，剪切反应将发生在底物识别序列3’-G-U-C-5’的5’端产物的3’-端为2’，3’环磷键，5’端为羟基GUC3′5′5′3′剪切ribozyme3.环状ribozyme：丁型肝炎病毒（HDV）RNA为~1700nt的环状结构，也能自剪切，但不形成上述两种结构。属于环状核酶。•催化：以一个胞嘧啶碱基上的N3作为一般的碱进行催化•产物：3’-端为2’，3’环磷键，5’端为羟基•其它环状核酶：植物病毒卫星RNA、类病毒RNA含有自我分裂顺序，可精确地分裂复制时产生的RNA连环体•优点：比线状RNA稳定，耐核酸酶降解（三）别构核酶（allostericribozyme)•某些RNA能形成动态结构，携带一个与活性部位分开的效应因子结合部位。配体与该部位结合后，可诱导相邻核酶结构的构象变化，提高或抑制催化作用。(四)寡核苷酸引导的人工内切核酸酶•是由ribozyme衍生而来的杂交分子•构成：断裂因子—底物序列识别片段—嵌合因子三部分靶序列：可以是RNA或单、双链DNA底物序列识别片段：识别部位，将催化剂本身引到底物序列处并结合。它一般是寡核苷酸片段，也可是与核酸专一性结合的蛋白，如阻遏蛋白等嵌合因子：使靶序列识别片段能与底物序列形成稳定的络合物断裂因子：可为金属鳌合物、光活性基团或核酸酶等，负责在特定部位切断靶序列3’5’靶序列•人工内切核酸酶结构示意图：人工寡核苷酸链嵌合因子断裂因子三ribozyme的底物多样性：目前发现的ribozyme可作用于包括RNA在内的多种底物：•以RNA为底物：如L19-IVS•1984发现第一个不以RNA为底物的ribozyme：兔肌-1,4-葡聚糖分枝酶RNA(共31nt，其中有8种共10个修饰核苷酸）——作用于葡聚糖•1990年发现以DNA为底物的ribozyme•1992年发现以氨基酸酯为底物的ribozyme，具有氨基酸酯酶和RNA限制性内切酶活性•1997年得到一组人造ribozyme，可催化肽链生成具有肽基转移酶活性•90年代初Noller等证明，大肠杆菌位于核糖体大亚基上的23S的rRNA负责催化肽键的生成，是核酶，而蛋白质只起到辅助作用。四ribozyme发现的意义：（1）证明了RNA具有催化功能，丰富了生物催化剂的概念（2）为RNA生命起源学说提供了证据（3）具有极好的应用前景:是研究RNA结构的有力工具在mRNA水平上阻断有害基因表达抗病毒感染抗肿瘤等第二节DNAzyme一什么是脱氧核酶（DNAzyme）：是利用体外分子进化技术合成的一种单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。•迄今为止，已人工合成大量具有各种催化功能的脱氧核酶。二脱氧核酶的体外筛选:•筛选系统：利用PCR为基础的体外“催化洗脱”5′3′armAarmB随机序列随机的多核苷酸单链DNA库40~50nt逆转录酶RNA引物armC生物素RNA-DNA杂交库过抗生素蛋白亲和柱碱变性固相化随机核酸库在一定温度、PH下，用一定的离子缓冲液（Mg2+)洗脱一搬经过10多轮筛选即可产生具有催化功能的分子。3′RNA引物armC生物素PCR新一轮随机单链DNA库三脱氧核酶的种类和功能•目前发现的脱氧核酶主要的功能1RNA切割作用：•脱氧核酶大都由结合部位和催化部位组成。结合部位通过碱基配对与底物RNA分子结合；而催化部位在RNA分子的一个未配对的嘌呤和一个已配对的嘧啶碱基处切割RNA。改变结合部位的碱基序列就可作用于不同底物RNA靶分子.•部分单链DNA分子依靠自身的结构变化具有RNA切割作用，也有的DNAzyme需要辅因子，如氨基酸及Mg2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+等二价金属离子。•切割RNA的DNAzyme代表：•1997年Santoro等获得的类似锤头型核酶的DNAzyme：10-23模型、8-17模型。•10-23模型特点：由29nt构成，催化中心有15个nt，两侧各有7个nt的互补结合手臂序列，用于结合底物RNA•切割发生在RNA中不配对的嘌呤（A,G)和嘧啶(U,C)之间产物3’-端为2’,3’环型磷酸基，5’端为自由羟基•最适切割条件：37ºC，PH7.5,2mmol/LMgCl2•催化效率比RNAaseA高10倍5’…NNNNNNNAUNNNNNN…3’||||||||||||||3’NNNNNNNANNNNNN5’AGGGCAACATCGATC2DNA切割作用Carmi等用体外进化的方式筛选出两类具有DNA自我切割作用的脱氧核酶:•Ⅰ类自我切割脱氧核酶：需要Cu2+和VC参与•Ⅱ类脱氧核酶：只需要Cu2+。Ⅱ类脱氧核酶以顺式方式切割DNA靶分子，与不加酶的反应相比，它提高催化效率106倍。而Ⅱ类脱氧核酶能与底物形成二联体或三联体形式，通过改变二联体或三联体的识别位点，就可以切割不同核苷酸序列的单链DNA分子。因此脱氧核酶还可以作为简单的限制性内切酶，位点特异性地切割单链DNA分子。3卟啉金属螯合作用和过氧化物酶活性•Li等分离到一个DNA配基（aptamer），能催化Cu2+和Zn2+螯合到卟啉环底物上.•优化产物：PS5.M：只有24nt、富含鸟嘌呤（G）形成一个G四聚体结构的催化活性中心，结合一个扭曲的卟啉分子，使卟啉分子类似于金属螯合反应的中间过渡态，从而促进了金属的螯合作用。PS5.M还能与血红素结合，形成的复合物具有过氧化物酶活性，能催化氯高铁血红素-氢过氧化物的分解。4DNA激酶活性•脱氧核酶还具有DNA激酶活性，类似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ磷酸基团转移到DNA的5’-OH上，实现DNA分子5’-OH端自我磷酸化。•脱氧核酶还能区分NTP和dNTP。其中一个优化的ATP依赖的脱氧核酶能特异性地选择ATP，高出CTP、GTP及UTP4000倍。相对于不加酶的ATP水解反应，脱氧核酶提高催化效率106倍。5DNA连接酶活性•具有连接酶活性的脱氧核酶，都能促进ATP依赖的自我“加帽”反应，即把ATP上的AMP基团转移到脱氧核酶自身的5′端磷酸基团上，形成5’,5’磷酸连接，与T4DNA连接酶活性相同。6其它酶活性：DNA激酶活性；N糖基化酶活性；DNA戴帽活性等四脱氧核酶的应用前景•与Ribozyme相比，DNAzyme最明显的特点是：（1）抗降解性强，稳定性较核酶高105倍；（2）结构简单，易于体外人工大规模合成（3）催化效率达109mol/min，远高于核酶（4）对底物（RNA）的切割催化作用也较核酶更呈位点专一和序列特异。•应用前景广阔：DNAzyme10-23能在RNA的A·U位点切割，理论上可切割任何mRNA的翻译起始密码AUG，这意味着几乎找到了可调控所有蛋白表达的万能钥匙，同时也为抑制RNA病毒的复制和治疗RNA病毒感染性疾病开辟了一条新途径。DNAzyme在恶性肿瘤的基因治疗、基因敲除实验方面意义突出，有可能在不久的将来走向临床。第三节类酶复合物•具有催化活性的抗生素被称为类酶复合物。•代表：博莱霉素。是一类含糖、含肽的抗生素，具有抗肿瘤活性①BLMA2：可切割DNA；有底物结合位和催化位;*与DNA的结合具有专一性，有G（鸟苷酸）特异性*催化需要Fe2+和O2，断裂位置在脱氧糖环的C3和C4之间*BLMA2催化前后结构不变②BLMA5（平阳霉素)*只作用于DNA不作用于RNA,对GC亲和力AT*催化需要Fe2+和O2，形成三元复合物酶学理论部分复习题•什么是酶？什么是生物催化剂？简述酶作为生物催化剂与一般催化剂的共性和特性。•酶分子中的氨基酸残基可以分为几类？各部分的功能如何？•举例说明影响酶催化反应高效性的因素。•什么是ks型和kcat型抑制剂?举例说明其作用机制•Ribozyme主要有哪几种类型？作用机制如何?酶动力学部分复习题1．某酶的Km值为310–4M，反应初始底物浓度为10-6M反应1分钟消耗5.0%的底物。（1）该反应的级数？（2）Vm？（3）反应5分钟底物消耗的百分比？4）转化75%的底物所需的时间？2．说明什么是双底物反应的“真正”Vm和Km。实验上如何求得Vm、KmA和KmB。3．利用以下数据求取：1）无抑制剂和有抑制剂时的Vm和Km值。2）抑制类型3）EI复合物的解离常数Ki值。反应初速度(M/分)S无抑制剂有抑制剂(210–3M)0.310–5M10.44.10.510–5M14.56.41.010–5M22.511.33.010–5M33.822.69.010–5M40.533.84．甘油醛-3-P脱氢酶（Mr=150,000)的活性位点有一个Cys残基，假定为使5ml、1.2mg/ml的酶完全失活，需要碘乙酰胺（Mr=185)，计算酶的催化亚基数目。5．某酶初提液经过一步纯化后，测得以下数据：试计算纯化后酶的比活、产量和纯化倍数。体积活力单位蛋白质初提液120ml200U/ml10mg/ml纯化后58ml10U/ml4.5mg/ml6．二异丙基氟磷酸盐同丝氨酸为活性中心的水解酶类不可逆结合，说明此种抑制剂的