免疫学检测技术及应用

免疫学检测技术及应用吕昌龙免疫学教研室免疫学检测技术应用：1.疾病的诊断、治疗效果评价及发病机理探讨：如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应、肿瘤等2.免疫分子的定性、定量测定：如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、补体、抗体等3.抗原物质的定性、定量检测：如：病原微生物及其代谢产物，组织细胞、蛋白质等4.免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：如：T细胞及其亚群等抗原－抗体反应抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。抗原抗体反应有以下几个特点:1.抗原与抗体结合是特异性结合表位(抗原)——超变区(抗体)2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Vanderwaal‘sforce)、电子云力的合力。抗原和抗体可解离,性质不变。3.抗原抗体反应可分为两个阶段（1）特异性结合阶段此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见反应出现（2）可见反应阶段需时较长,数分,数小时或数日出现可见现象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现象,与两者的分子比例密切相关抗原抗体反应的主要影响因素：1.电解质:在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。2.温度:37℃3.酸碱度:pH6-8抗原抗体反应包括：沉淀反应凝集反应溶解反应补体结合反应中和反应已知抗体检测未知抗原；已知抗原检测未知抗体。Sensitivityofvariorimmunoassays一、沉淀反应(precipitation)可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。沉淀反应的试验方法：环状法絮状法琼脂中沉淀法琼脂中沉淀反应法：•双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)•单向免疫扩散(singleradialimmunodiffusion)•对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)•火箭电泳(rocketelectrophoresis)•免疫电泳(immunoelectrophoresis)二、凝集反应(agglutination)颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。凝集反应包括：◆直接凝集反应(directagglutination)◆间接(被动)凝集反应(indirect/passiveagglutination)◆间接凝集抑制试验(indirectagglutinationinhibitiontest)◆协同凝集试验(coagglutinationtest)◆抗球蛋白试验(antiglobulintest，Coomb’stest)三.免疫标记技术用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体)的存在或含量的方法。灵敏度：高，1X10-4～1X10-5ug抗体/ml应用：微量物质的定性、定量或定位。免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)（二）免疫酶技术(immunoenzymatictechnique)（三）同位素标记技术(isotopelabellingtechnique)（四）发光免疫测定(luminescentimmuno-assay,LIA)（五）免疫胶体金标记技术(colloidalgold／immunogoldstaining)（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术)原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等)标记抗体(荧光抗体)，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。免疫荧光技术包括：直接法间接法间接补体增强法Directandindirectimmunofluore-scencestainingofmembraneantigen(mAg).（二）免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。主要有两种类型：1.免疫酶染色2.酶免疫测定（enzymeimmunoassay,EIA）1.免疫酶染色(又称免疫组化技术,immunohistochemistrytechnique)原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。2.酶免疫测定酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载体；②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶促反应。灵敏度：2X10-5μg／ml应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。ELISA法：直接法间接法双抗体夹心法(双位点法)竞争法ELISA(三)同位素标记技术(isotope-labellingtechnique)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。优点：灵敏度高,可检测0.001pg／mL特异性强应用：微量抗原和抗体检测。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。（四）发光免疫分析(luminescentimmuno-assay,LIA)原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。应用：定量检测抗原、抗体。发光分为：化学发光(chemiluminescence)生物发光（bioluminescence）化学发光原理：发光物质激发态分子基态分子释放光子(发光)化学发光剂：鲁米诺（luminol）反应剂：过氧化阴离子反应剂（五）免疫胶体金技术(colloidalgold／immunogoldstaining)原理：胶体金标记蛋白质(如抗体)+组织细胞(待测)观察结果(用电镜、光镜或肉眼)应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。淋巴细胞的检测技术一.淋巴细胞的分离1.外周血单个核细胞(淋巴细胞90%)的分离密度梯度离心法(密度为1.077)(2000rpm,15min)2.尼龙纤维分离法：单个核细胞通过尼龙纤维柱B细胞和单核细胞(粘附特性)T细胞(非粘附性)。3.流式细胞术（flowcytometry,FCM）：荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过FACS分离（荧光素不同）的细胞*FACS：荧光激活细胞分类仪(fluore-scentactivatedcellsorter)流式细胞仪4.磁珠分离术：(1)直接法：免疫磁珠(磁性微粒结合抗体)+细胞通过磁场分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞(2)间接法：免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体)+细胞+抗体通过磁场分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法1．淋巴细胞增殖检测•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）:间接观察DNA合成含量。灵敏度高，具有放射性。•四甲基偶氮唑盐法（MTT）:MTT商品名为噻唑蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）,DMSO使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。•二甲氧唑黄比色法（XTT）：XTT是一种MTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。•四唑单钠盐法（WST-1）:WAT-1是一种类似于MTT的水溶性四唑盐，在PMS存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1的水溶液比MTT和XTT稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。•Cell-CountingKit-8（CCK-8）:CCK-8中含有WST-8，较WST-1更新的四唑盐，检测原理与WST-1类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。（放射性核素摄取法）2.细胞毒试验(1)NK细胞的细胞毒活性测定①放射性核素释放法放射性核素标记靶细胞(K562细胞)+效应细胞培养靶细胞破坏，释放放射性核素测cpm值NK细胞毒活性(%)=100%实验孔cpm值-自然释放孔cpm值最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值②乳酸脱氢酶(LDH)释放法靶细胞(YAC-1细胞)+效应细胞(小鼠脾胞)LDH释放+LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝)形成甲基化合物(色)测定OD570值NK细胞毒活性(%)=100%实验孔OD值-自然释放孔OD值最大释放孔OD值-自然释放孔OD值Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity(ADCC）GenerationofeffectorCTLsMHCtetramersTwopathwaysoftarget-cellapoptosisstimulatedbyCTLsInvitrocell-mediatedlympholysis(CML)assay3.酶联免疫斑点法(ELISPOT)抗原包被B细胞抗体产生并附着第二抗体(酶标记)底物显色抗体(抗细胞因子)包被+T细胞产生细胞因子并与抗体结合+第二抗体(酶标记)底物显色（二）体内法抗原定量注入皮内，48～72小时后观察结果。结果判定：阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm弱阳性：硬结直径0.5cm阴性：无变化实际意义：阳性——细胞免疫功能正常者弱阳性或阴性——多为细胞免疫功能低下者*常用的抗原为结核菌素(OT)、PHA皮内注射法划痕法细胞因子的检测技术一、生物学检测技术依赖细胞株测定法二、免疫学检测技术ELISA法三、分子生物学检测技术分子杂交、PCR等检测mRNA细胞因子检测的特点•样品含量低•样品具有时效性•生物效应特异性差Figure14-12细胞因子的功能CellactivationCellgrowthanddifferentiationInductionofMHCInductionofcytokinereceptorsPromotionofantibodyclass-switching影响细胞因子作用特异性的因素Onlyantigen-activatedlymphocytesexpressreceptorsDifferentcombinationsofreceptorsubunitsresultinlow-,intermediate-,orhigh-affinityreceptorsRequirementofcell-cellinteractionShorthalf-lifeofcytokinesCytokineantagonistsSynergisticandantagonisticinteractionsamongcytokines限制细胞因子临床应用的因素HighlocalconcentrationsofcytokinesduringimmuneresponsecannotbemimickedclinicallyShorthalf-lifeofcytokinesPleiotropiceffectscancauseunpredictableside-effects细胞因子的生物学检测检测方法与原理细胞增殖或增殖抑制试验细胞病变抑制试验细胞毒试验细胞趋化试验检测中的操作注意要点靶细胞的选择与培养检测标本的制备显示检测结果202