83 吸光光度法的灵敏度与准确度 - 北京工业大学

11显色反应8.3显色反应及其影响因素2显色剂3显色条件的确定5测定中的干扰以及消除方法4测量条件的选择2为什么显色？官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度33Fe2+3NN+NNFe2+桔红色510邻二氮菲有机物质无机物质1显色反应：被测组分转变为有色化合物的反应3对显色反应的要求选择性好，显色条件易于控制，重现性好；灵敏度高，一般ε104;生成的显色化合物稳定；显色化合物与显色剂的颜色差异大，显色剂在测定波长处无明显吸收,对照性好,Δmax60nm4显色反应的类型（1）氧化还原反应：如测水中的Mn2+，用过硫酸铵将Mn2+氧化为紫红色MnO4-，在波长525nm处有强吸收（2）络合反应：对无机阳离子的显色反应，如Fe2+与邻二氮菲的络合物在510nm处有强吸收52显色剂无机显色剂：有机显色剂：多为螯合剂，形成的络合物稳定、选择性好，灵敏度高等，常用6有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOHOHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙，能与20多重金属离子形成有色鳌合物NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸73显色条件的确定——单因素试验法CRCR1）显色剂用量（λMAXCM、pH一定）作A~CR曲线，寻找适宜CR范围ACR一般选择线性范围内有最大吸光度、且显色剂用量最少的点。在测定波长λMAX、被测组分浓度CM一定条件下，影响显色反应的因素有：显色剂用量、pH、温度、反应时间、干扰组分等8酸度的影响副反应M+nR=MRnOH-H+存在型体的变化RH=R-+H+12生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色2)显色反应酸度反应的完成程度93[FeR]lg[Fe]pH3～8为适宜的酸度范围邻二氮菲－亚铁反应完全程度与pH的关系10固定CM、CR，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。pH1pHpH2ApHpH1pH2113)显色温度及显色时间(CM、CR、pH一定)作A~T曲线，确定适宜反应温度。ATATATAtAt反应时间的选择:作A~t曲线，寻找适宜反应时间。124）溶剂的选择：测量波长应大于透明区波长CHCl3245乙醚210苯280环己烷210己烷210CCl4265正丁醇210庚烷210DMF270二氯甲烷235甲醇215丙酮330二氧六环235异辛烷210吡啶303乙醇210水191硝基甲烷380对溶剂的要求1.低极性2.易溶解被测物3.稳定4.在样品的吸收光谱区无明显吸收常用溶剂的光学透明区134测量条件的选择无干扰，选择max有干扰时1)测量波长的选择2)待测溶液吸光度的选择控制A=0.15~1T=70%~10%方法1、非单色光影响小2、灵敏度高A选择C选择LAmax143)参比液的选择原则：扣除比色皿、样品基体（非待测组分）和显色剂的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-Rmax试样显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基体吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂+溶剂基体吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分掩蔽剂若欲测M-R的吸收maxA（样）=A（待测吸光物质）+A（干扰）+A（池）A（参比）=A（干扰）+A（池）15例:邻二氮菲光度法测水中的Fe，1）若显色剂及其他试剂有颜色，参比溶液：溶剂+所有试剂。2）若待测样品中有干扰组分与显色剂反应生成有色物质，参比溶液：待测样品+所有试剂+被测组分掩蔽剂参比溶液选择举例165测定中的干扰以及消除方法1）控制溶液pH2）加入掩蔽剂3）改变干扰离子的价态4）采用适当的光度测量条件和方法5）选择适当分离方法消除干扰171、绝对法：测定样品的吸光度，由A=εcL求出c，但须知吸光系数ε、光程L2、标准对照法：在同样条件下分别测定标准溶液（浓度为已知c标）和样品溶液的吸光度，然后求出被测样品的浓度3、标准曲线法：校正4、回归分析法：c=aA+b,a,b为回归系数5、解联立方程组：利用吸光度的加和性，求多组分的浓度6、双波长分光光度法：自学7、示差分光光度法：透光率调零和100%的方法不同用cscx的标准溶液调T=0%或用cscx的标准溶液调T=100%8.4吸光光谱法的定量方法单组分测定多组分测定A440cx标准曲线法的准确性与两个因素有关：（1）标准物浓度配制的准确性；（2）标准试样基体与样品基体的一致性。0.0520AA2A3A10.00.20.40.60.81.01.230Ax浓度cAx工作曲线法：用分析物的纯样准确配置一系列已知浓度的标准试样，测得每一浓度对应的吸光度A后，以A对浓度C作图。19解联立方程法多组分的测定AXY12根据吸光度加合性原则yxAAA111yyxxbcbc11yxAAA222yyxxbcbc22解联立方程，可求得Cx,Cy为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。ACs(x)x1x220天然水中Fe2+的测定废水中Cd2+测定：双硫腙比色法（λmax=518nm）水中微量酚的测定：4—氨基安替比林分光光度法（λmax=510nm）水中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮及总氮的测定8.5应用实例21配置标准溶液、绘制特征吸收曲线，确定λmax①配制系列标准溶液0、C标1C标2。。。，显色反应：Fe2++3phen=Fe(phen)2+3②测量同一浓度标准溶液不同波长下的吸光度，每隔10nm测定一次，找出最大的吸收波长λmax(每变化波长，用空白溶液重新调零)（λmax=510nm）做工作曲线（标准曲线）、测水样Fe2+③用1cm比色皿在λmax=510nm下测定标准溶液的吸光度A标，绘制标准曲线A标~C标④未知水样显色反应，测未知水样的A未，在该标准曲线上找出相应的C未1铁的测定22总铁的测定在水样中加NH2OH·HCl（盐酸羟胺）或抗坏血酸还原Fe3+:重复Fe2+的测定步骤23FeeFe测量范围：水中0.03~5.0mg/L的铁23干扰及消除干扰：消除方法：强氧化剂、氰化物、亚硝酸盐、焦磷酸盐、偏聚磷酸盐及某些重金属离子经过加酸煮沸可将氰化物及亚硝酸盐除去，并使焦磷酸、偏聚磷酸盐转化为正磷酸盐以减轻干扰。加入盐酸羟胺则可消除强氧化剂的影响。邻菲啰啉能与某些金属离子形成有色络合物而干扰测定在乙酸-乙酸铵的缓冲溶液中，不大于铁浓度10倍的铜、锌、钴、铬及小于2mg/L的镍，不干扰测定；当浓度再高时，可加入过量邻菲啰啉显色剂予以消除。汞、镉、银等能与邻菲啰啉形成沉淀，若浓度低时，可加过量邻菲啰啉来消除；浓度高时，可将沉淀过滤除去。水样含有大量有机物或底色较深，可用不加邻菲啰啉的试液作参比，对水样的底色进行校正，或将水样蒸干、灰化后用酸重新溶解再测定。242水中含氮化合物的测定1）氨氮——①纳氏试剂光度法NH3NH3H2ONH4+OH-NH3K2HgI4KOH[Hg2ONH2]I+H2O++2+3+7KI+2H2O黄棕色（λmax=420nm）注意事项：1）测定范围0.025~2mg/L；2）水中氨氮含量1mg/L直接用纳氏试剂测定,[NH3]1mg/L或样品基体颜色或浊度高时需预先蒸馏蒸出NH3后再用纳氏试剂测定；或对水样絮凝沉淀预处理后测定3）[NH3]5mg/L时直接用酸碱滴定测定纳氏试剂（碘化汞和碘化钾的强碱溶液）25②蒸馏-滴定法适合于氨氮浓度较高的水样，方法检出下限为0.2mg/L。先用蒸馏法将氨蒸出，吸收于硼酸溶液中，再用酸标准溶液滴定馏出液中的铵③电极法是利用氨气敏复合电极进行氨氮的定量测试，该法不受水样颜色和浊度的干扰，水样不必进行预处理，测定范围为0.03-1400mg/L。26N－(1-萘基)－乙二胺比色法1）在酸性溶液中，NO2－与对氨基苯磺酰胺生成重氮盐：2）重氮盐与N-（1-萘基）-乙二胺偶联生成红色染料：（红色染料）（λmax=540nm）OHNClNHCSONHHNOHClNHHCSONH246222246222重氮化HClHClHCNHCHNNHCHNHCSONHHClNHCHNHCHHCNClNHCSONH227102246222227104622偶联2）亚硝酸盐氮：N－(1-萘基)－乙二胺比色法（GB13580.7-92）、α－萘胺比色法（GB13589.5-92）和分光光度法（GB7493-87）、离子色谱法等。273）硝酸盐氮硝酸盐氮的测定方法主要有酚二磺酸光度法（GB74８0-87）、麝香草酚分光光度法、紫外分光光度法、镉柱还原法、离子色谱法和电极流动法等。28①酚二磺酸光度法OHH2SO4OHSO3HHO3SOHSO3HHO3SNO3-OHSO3HHO3SNO2OH-OHSO3HHO3SNO2NH4OHSO3NH4NH4O3SONOONH4+4+2H2O+++3+3H2O黄色化合物（λmax=410nm）29②麝香草酚分光光度法测量原理：硝酸盐和麝香草酚在浓硫酸溶液中形成硝基酚化合物，在碱性溶液中发生分子重排，生成黄色化合物，415nm下测定。适用于低浓度水样中硝酸盐氮的测定，最低检测质量浓度为0.12mg/L硝酸盐氮（以N计）。干扰与消除方法：亚硝酸盐对本规范呈正干扰，可用氨基磺酸铵除去；氯化物对本规范呈负干扰，可用硫酸银消除30③紫外分光光度法水样经预处理后，分别在220nm、275nm处测2次吸光度，根据两次吸光度值，引入吸光度的经验校正值A校，进行定量测定。A校＝A220－2A275式中，A220—220nm波长处测得的吸光度，包括硝酸盐+溶解有机物产生的吸收；A275—275nm波长处测得的吸光度，仅有机物产生吸收。314）凯氏氮凯氏氮是指以凯氏（Kjeldahl）法测得的含氮量，包括氨氮+有机氮化合物（在此条件下能被转化为铵盐的有机物）有机氮=凯式氮-氨氮32凯氏定氮法原理消化：样品与浓硫酸和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。蒸馏：加碱蒸馏，使氨蒸出。吸收：用H3BO3吸收滴定：以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。或纳氏试剂光度法测氨氮测定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定OHNHSONaNaOHHSONH2342422233凯氏定氮装置1.安全管2.导管3.汽水分离器4.塞子5.进样口6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生器1.消化样品浓H2SO4CuSO4·5H2OK2SO4样品空白2.蒸NH334食品和其原料中蛋白质含量的测定，国内外普遍应用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。蛋白质换算系数：=N×6.25=蛋白质含量16%N凯氏法测定牛奶中的蛋白质含量35牛奶造假凯氏定氮只能测出含氮量而无法测出氮的来源。一些非蛋白原料,如尿素以及尿素类成品可以通过检测氨氮的方法检测出来,而三聚氰胺抗氨氮测定三聚氰胺分子式:C3N6H6，是一种重要的氮杂环有机化工原料。其分子中含氮量为66.6%,折合成粗蛋白含量为416.27%,掺入少量就可以迅速提高蛋白含量。加上三聚氰胺为白色粉末,易被染色,很容易混入原料中而不被发现。三聚氰胺结构式365）总氮测试方法：过硫酸钾氧化－紫外分光光度法（GB１１８９４-８９）和加和法（凯氏氮、硝态氮）、仪器法等。过硫酸钾氧化－紫外分光光度法测定原理：在120－124℃的碱性介质条件下，用过硫酸钾做氧化剂，不仅可以将水中的氨氮和亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐，同时可以将大部分有机氮化合物氧化为硝酸盐。然后用紫外分光光度法测定。该法主要适用于湖泊、水库、江河水中总氮的测定。其中总氮及各种形式氮的含量均以氮的mg/L计37（1）分光光度法测定水