无创产前技术

无创产前胎儿DNA检测技术简介唐氏综合征47,XY,+2121-三体综合征，又称先天愚型或Down综合征，是小儿最为常见的常染色体畸变疾病。我国活产婴儿中21-三体综合征的发生率约为1/600～1/800，男女之比为3︰2，60%的患儿在胎儿早期即夭折流产。传统产前诊断技术无创产前诊断方法游离胎儿DNA胎儿细胞游离胎儿RNA孕妇外周血胎儿细胞（fetalcell）种类滋养层细胞、胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞特点包含完整的胎儿基因组可反映胎儿全部遗传信息数目少，限制其应用于无创产前诊断游离胎儿DNACell-freefetal(cff)DNADennisLo卢煜明特点：1含量是孕妇血液中胎儿细胞DNA的970倍2含量有一定的变化规律，妊娠第5周开始可以检测出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，存在个体差异3分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min（4-30min），2h后没法检出。ChrN:100Chr21:100理论模型正常胎儿21三体胎儿Descriptionofthecontents正常胎儿Chr11:2000Chr21:20001000基因等分/ml（含50等份的胎儿基因;950等份的母亲基因）ChrN:1900Chr21:1900ChrN:100Chr21:150母亲21三体胎儿ChrN:2000Chr21:2050统计结果:T21正常胎儿血浆技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核医院血样采集血样寄送包装技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核医院4℃，1600g10min4℃，16000g10min残留细胞取上清样品处理两步法分离血浆：-80保存在样品制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格品：(1)血浆分离后存在明显的溶血；(2)分离后血浆体积未达到最低要求(要求大于1.2ml)；(3)血浆全部用于DNA提取后总量未达建库最低要求(30ng)；(4)DNA提取过程中，阴性对照可以检测到浓度。样品处理DNA提取使用微量样品基因组提取试剂盒(天根，DP316)进行血浆游离DNA提取技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核末端修复和加“A”接头连接TDNAinsert+PCRP5P7Index公用P1IndexPCRprimerDNAinsertP5P7IndexSP1SP2IdxSPP7P5PCR扩增2100检测片段大小文库质控电泳结果在文库制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格文库：(1)电泳检测后发现接头未连接；(2)电泳检测或2100检测后发现存在接头污染；(3)2100检测后发现文库片段大小不合格，文库主峰大小为290bp左右，次峰大小为450bp左右；(4)定量检测后，发现文库的浓度过低(浓度低于30ng/ul)文库不合格标准技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核将被打断成几百个碱基（或更短），并在两个末端加上接头(adapter)的基因片段按一定浓度进行稀释。将基因片段固定在芯片(FlowCell)上。由于芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，经处理后的碱基片段与芯片上的引物进行互补连接，被“固定”在芯片上。引物扩增，以样品为亲本链，使芯片引物延长形成复制链。ClusterGenerationOHFlowCell接头diolP7P5dioldiol模板杂交dioldiol延长dioldiol变性剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)。形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。dioldiol1stcycle变性1stcycle退火dioldiol1stcycle延长dioldioldioldiol2ndcycle变性2ndcycle退火dioldioldioldioldioldiol2ndcycle延长n=35总数线性化OH用ddNTP()阻断Cluster扩增完成OHdioldiolOHPrimer加测序引物OHCAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’FirstbaseincorporatedCycle1:AddsequencingreagentsDetectSignalCleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat边合成边测序原理可逆阻断技术BaseCalling123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…HiSeq2500概况PESBSASBSB注射泵试剂舱光学控件Flowcell舱盖鼠标键盘试剂舱与样品舱PE试剂吸管把手2个样品孔，同时上机2个文库3个试剂架–2个SBS架–1PE架RaisingreagentracksippersPESBSASBSBHiSeq2500试剂•测序试剂–安装约15minutes–每次使用需更换试剂瓶盖–试剂舱恒温FlowCell平台•Flowcells用真空吸附•LED显示真空吸附FC的情况把手Gasket•面积更大,双边面设计(8lane)–增加了5倍面积–保留8lane设计–25mm宽X75mm长–Lanes1.7mm宽–只适用于cBotFlowCell的设计双面使用•更快的成像•线扫描•TimeDelayIntegration(TDI)成像系统•对flowcell的两个表面clusters进行扫描•更大的测序通量输出成像•4CCDcameras•4个碱基图像同时捕获–先扫描上表面(all4colors)–再扫描下表面(all4colors)ATCGFlowCell线扫描Swath•把一个lane的一半定义为一个swath•CamerasoperateinTDI–不间断的输出图像swathsyFlowCellSwath/TileFlowCellSwathTileHiSeqControlSoftware(HCS)把1个swath划分为8个部分(tiles)HiSeqControlSoftware(HCS)操作界面更加简单的操作•Step-by-steprunsetup人性化的recipe实时监控试剂跟踪帮助菜单HiSeqControlSoftware(HCS)•HCS应用于整个RUN的流程:–建立RUN的信息及参数–进行测序–对整个RUN进行监控–对一些操作步骤进行提醒(e.g.,安装试剂,FC,priming,wash)测序准备工作建立测序信息进行测序(run)对整个RUN监控HCS操作界面FirstBase报告•若在操作界面上选取了ConfirmFirstBase,就会弹出FirstBase报告进行这个RUN的初步评判OptionselectedduringRunConfigurationHiSeq2500HCS软件•HCS软件初步数据分析结果HiSeq2500HCS软件•一个RUN的ImagesThumbnail概况HiSeq2500数据分析ASimple,FamiliarWorkflowHiSeqCONTROLSOFTWAREReadGenerationimagesintensitiesbasecallingalignmentbiologicallymeaningfulresultsCASAVAAlignments,variations,buildsVISUALIZATIONGenomeStudio,orfavoritebrowser基因信息分析通过alignment(比对),获得所测得的每条序列的位置信息.依据这些位置信息,我们可以把每条序列定位到相应的染色体上.统计所有的序列分布情况,我们就可以获得分布在每条染色体上的序列条数.T21样品分布在21号染色体上的序列条数比正常eupoid（二倍体）的样品的多.通过统计学上的检验,我们可以依据多的量检出T21或其它染色体非整倍性变异.样品类型质量等级预期密度(k/mm2)产量标准(Mreads)质量标准PF%Q20(%)Q30(%)产前(50cycles)优秀50020090=95=90合格33015085=85=80原始数据质量标准下机数据质控格式转化后，统计每个reads长度，将大于50bp长度的reads截短至50bp，将不足50bp长度的reads舍去。其后，对每一个样品的reads数据进行质控，统计每个样本的数据量，将原始数据量小于300M的样本标记。同时分析reads的质量值和GC值是否有偏差，并画出图谱。过滤数据质控过滤原始数据后，若舍去数据在10%以上，通常表明下机数据质量偏差。此时，可再次对每一个样品的cleanreads进行质控，画出reads的质量值和GC图谱，分析cleanreads的质量值是否有所提高，GC是否趋向稳定等等。若过滤后这些值依然偏差，则可考虑数据重测。比对数据质控数据比对后，统计所有完全比对到基因组上唯一位置的reads数所占cleanreads的比率，若比值小于50%，需分析原因，必要时考虑数据重测。Z值结果质控对所有染色体的Z值进行统计，若Z值总和大于50并且单个染色体最大Z值小于6，标记为“Unqualifiedsamplesuspicion”。分析原因，必要时考虑数据重测。