定量PCR的原理(AB公司)

定量PCR的技术原理2Real-timePCR的定义•Real-timepolymerasechainreactionInmolecularbiology,real-timepolymerasechainreaction,alsocalledquantitativerealtimepolymerasechainreaction(Q-PCR/qPCR)orkineticpolymerasechainreaction,isalaboratorytechniquebasedonthepolymerasechainreactionwhichisusedtoamplifyandsimultaneouslyquantifyatargetedDNAmolecule.Itenablesbothdetectionandquantification(asabsolutenumberofcopiesorrelativeamountwhennormalizedtoDNAinputoradditionalnormalizinggenes)ofaspecificsequenceinaDNAsample.FromWikipedia,thefreeencyclopedia内容•AB公司定量PCR仪发展历史•定量PCR的数学原理•定量PCR的化学原理•定量PCR的光学原理4AB公司定量PCR仪产品概览5AB公司定量PCR仪的发展历史1995世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生1997推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪2000推出7900型384孔定量PCR仪2001推出7900型96孔定量PCR仪2001推出7000型96孔定量PCR仪2004获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位2004第3代定量PCR仪7300\7500型诞生2007第4代定量PCR仪StepOne和StepOnePlus问世6AB定量PCR仪家族第一代77005700第二代70007900第三代73007500第四代stepone/plus7精良的性能9个数量级融解曲线1倍分辨率相对定量软件8定量PCR的数学原理9什么是PCR?PCRDreischrittreaktion变性95°C退火50-60°C延伸72°C循环反应PCR产物指数扩增模板变性解链，引物退火结合引物延伸引物与模板PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应10PCR：循环与扩增RprimerFprimer3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'链式反应的雪崩效应3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'模板，引物，dNTP缓冲液、镁离子DNA聚合酶1、2、4、8、16…N=N0x2n235=34,359,738,368三百四十亿！11将一滴PCR产物加入一个游泳池中，搅拌均匀，则游泳池中的每一滴水含有100个拷贝的DNA序列！12PCR动力学曲线和四个阶段线性图谱半对数图谱平台期线性增长期基线期指数增长期平台期线性增长期基线期指数增长期13起点定量与终点定量相同样品进行96次扩增，由于PCR扩增效率的差异，扩增终产物的量存在很大的差异起始DNA量是“天然”的量，最具代表意义；终点DNA量是经过“加工”的量，存在一定的“失真”。起点定量法重现性好，终点定量误差较大。为什么需要real-timePCR?!14荧光定量PCR数学原理基线阈值Ct值[DNA]015什么是基线？反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值半对数图谱线性图谱基线阈值Ct值[DNA]016什么是阈值？基线阈值Ct值[DNA]0阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍。17什么是Ct值？(thresholdcycle)Ct值半对数图谱Ct值线性图谱基线阈值Ct值[DNA]0扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数18为什么CT值∝[DNA]0？lg[DNA]循环数线性期指数期N=N0x(1+e)nN：产物分子数；N0：起始分子数e：扩增效率；n:循环次数PCR产物量与扩增循环数间的理论方程：19第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。Rn=RB+X0(1+e)nRs设n=Ct，则：RCt=RB+X0(1+e)CtRsRCt–RB=X0(1+e)CtRslg(RCt–RB)=lg[X0(1+e)CtRs]lg(RCt–RB)=lgX0+Ctlog(1+e)+lgRsCtlg(1+e)=–lgX0+lg(RCt–RB)–lgRslglg()lglg(1)lg(1)OTBStXRcRRCee−−=−+++即Ct=klgX0+b（线性方程，K为负值，lgX0越大，则Ct越小。）移项：两边取10为底的对数：变换：移项：两边除以lg(1+e)：bK仪器检测PCR产物的量与扩增循环数间的理论方程：20从荧光信号到定量结果BaselineThresholdCtvalueRnCycles第一步：检测荧光增长，获取样品的Ct值21从荧光信号到定量结果第二步：绘制标准曲线LogcopynumberCtvaluesCt‘s0123456722从荧光信号到定量结果第三步：以待测样品的Ct值对[DNA]0作图，得到定量结果Ct值lg[起始DNA]Ct=klgX0+b23定量PCR的的化学原理24荧光25荧光的发生原理荧光基团发光原理：在一束特定波长（如500nm）激发光源的照射下，荧光基团的电子向高能级跃迁，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放出特定波长的光（如600nm），这个光称为发射光。由于电子从高能级跃迁回来的时候会损失部分能量，发射光的能量会比激发光能量小，结果是发射光的波长比激发光波长长。荧光基团、激发光、获能、电子跃迁、电子回迁释放能量、发射光Light26常用的荧光标记方法●DNA双链特异性染料SYBRGreen、LCGreen、Cyto9、Evagreen●序列特异性探针TaqmanMolecularBeacons（分子信标）DualProbes(FRET)LNA(LockedNucleicAcid)Double-Dyeprobes27各种标记方法的使用频度28荧光标记方法的原理•探针−TaqMan−TaqManMGB•染料−SYBRGreenI29TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补•一条寡聚核苷酸单链•探针序列与检测目标序列互补•5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等•3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)30|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|6/8/2010报告基团淬灭基团31荧光共振能量传递FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。QRQR32能量转移激发光完整的探针：5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET）报告基团无荧光信号产生33断裂的探针：报告基团与淬灭基团分离，5′端荧光基团吸收能量后无法将能量转移给远离的3′端淬灭基团，得以发光（FRET失效）。Lightenergy34变性(95ºC)TaqMan水解探针作用机理35退火(60ºC)TaqMan水解探针作用机理36TaqMan水解探针作用机理37TaqMan水解探针作用机理38TaqMan水解探针作用机理39TaqMan水解探针作用机理40TaqMan水解探针作用机理41?TaqMan水解探针作用机理42Taq酶的特性：•5′--3′外切酶活性•从5′端水解探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离TaqMan水解探针作用机理43TaqMan水解探针作用机理44TaqMan水解探针作用机理45TaqMan水解探针作用机理46TaqMan水解探针作用机理47TaqMan水解探针作用机理48TaqMan水解探针作用机理49TaqMan水解探针作用机理50TaqMan水解探针作用机理51TaqMan水解探针作用机理52TaqMan水解探针作用机理53TaqMan水解探针作用机理54TaqMan水解探针作用机理55TaqMan水解探针作用机理56TaqMan水解探针作用机理57TaqMan水解探针作用机理58TaqMan水解探针作用机理59TaqMan水解探针作用机理60TaqMan水解探针作用机理61TaqMan水解探针作用机理62Burp!TaqMan水解探针作用机理63TaqMan探针的作用机理1.每产生一条DNA链，就切断一条探针2.每切断一条探针，就产生一个单位信号3.信号强度与结合探针的DNA分子数成正比5’TaqMan探针上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QR64TaqMan探针的优缺点特异性高序列特异性的杂交探针，增强了检测的特异性适用于多重PCR体系实现单管检测多个靶标成本高需要合成特定探针，单位试剂价格较染料法高探针设计问题需要专门的软件设计；多重PCR中的探针用不同荧光区分65TaqMan-MGB探针——新型的Taqman探针NFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||QAGGCCTTGAGAGATATRQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB(minorgroovebinder)提高探针Tm值比普通Taqman探针更短13bpVS25bp;3’端偶联小沟结合物（MGB）；特异性结合模板时的Tm值更高；采用非荧光淬灭基团66FAMMGB完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号分辨1个碱基的精确度RQMGBNFQ5′3′67TaqMan-MGB探针的优势●背景更低，提高检测信噪比；淬灭基团不发出荧光，且与染料类淬灭基团相比，具有更高的淬灭效率。●提高探针结合的严谨度，提供更高的分辨率；提高探针的Tm，能分辨一个碱基的差异。●缩短探针的长度，便于实验设计探针可以少至13个碱基，设计更为灵活68SYBRGreenI染料DNA双链特异性，非序列特异性69SYBRGreenI作用机理707172SYBRGreenI的作用机理1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2.染料一结合，就产生荧光信号3.信号强度与DNA分子总数目成正比73熔解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即该产物序列的Tm。74SYBRGreenI的优缺点●成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜●适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认●配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体●特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号●多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因75多重