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2.DNA连接酶在基因工程中起到“针线”的作用，可以将DNA片断的粘性末端之间的缝隙“缝合”起来，使之重新组合为完整的DNA分子。连接酶的缝合作用3.基因的运载工具-运载体作为运载体的条件：(1)有某种限制酶的一个切点,最好是有许多种限制酶的切点,而且每种酶的切点只有一个;(2)外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制,载体应对受体细胞无害,以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段;(3)有利于选择的标记基因,可以很方便地知道外源DNA已经插入,以及把接受了载体的受体细胞选出;(4)具有促进外源DNA表达的调控区。常用的运载体主要有两类：(1)噬菌体或某些动植物病毒(2)细菌细胞质的质粒大肠杆菌噬菌体λ当噬菌体感染宿主细胞后,双链DNA分子通过cos而成环状。在感染早期,环状DNA分子进行转录.在此期间,噬菌体有两条复制途径可供选择:(1)裂解生长。环状DNA分子在宿主细胞里复制若干次,合成了大量的噬菌体基因产物,形成子代噬菌体颗粒。(2)溶源性生长,噬菌体DNA整合进宿主菌的基因组。质粒存在：存在于细菌及酵母菌的染色体以外。特性：是很小的环状DNA分子，在细胞染色体外能够自我复制。大肠杆菌质粒是大肠杆菌中发现的染色体外的遗传因子,它是闭合环状的双链DNA分子。应用的最广泛的质粒载体是pbr322,它属松弛型质粒,有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因,有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸,排列顺序已全部测定。大肠杆菌噬菌体λ的抑制子(二)基因工程的步骤四个基本步骤：提取目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达1.提取目的基因可应用的目的基因主要有：苏云金芽孢杆菌抗虫基因、植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子的贮藏蛋白的基因、人的胰岛素基因、干扰素基因等。从细胞中取出DNA用限制性内切酶切断DNA获得目的基因DNA序列自动测序仪DNA测序仪显示的碱基排列顺序获得目的基因的两种途径两种方案直接取自供体细胞人工合成（鸟枪法）供体DNADNA片段限制酶目的基因扩增筛选两条途径信使RNA逆转录合成目的基因推测肽链氨基酸序列信使RNA序列基因DNA序列目的基因DNA合成仪2.目的基因与运载体结合用特定的限制酶切割质粒，然后将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。细菌的质粒供体细胞的DNA切割DNA切割DNA目的基因粘性末端目的基因重组DNADNA连接酶(同种限制性内切酶)（目的基因的提取以及其与运载体的结合）DNA质粒提供质粒细菌供体细胞同种限制酶DNA连接酶重组DNA（重组质粒）3.将目的基因导入受体细胞重组DNA4.目的基因的检测和表达(1)检测的意义：鉴别目的基因是否真正导入受体细胞。(2)检测方法：大肠杆菌质粒具有抗青霉素基因（标记基因），只要检测受体细胞具有抗青霉素的能力，就说明导入了目的基因。(3)目的基因的表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因导入和完成表达过程。多细胞生物的检测将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。动画：实例人们通过基因工程培育一种抗虫棉，它可以产生毒素，杀死害虫。毒素是蛋白质，表达它的基因是从苏云金芽孢杆菌中提取出来，放入棉的细胞中，与棉细胞中的DNA结合起来，在棉中表达并发挥作用。苏云金杆菌毒蛋白基因质粒质粒构建农杆菌棉花棉花细胞侵染转移转基因棉花抗虫棉的构建长“眼睛”的土豆反对转基因食品卫士课外扩展