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转录因子Ｓｐ１对成肌细胞中猪ＳＫＩＰ的表达调控作用摘要：利用基因组ｐｃｒ步移方法获得猪ｓｋｉｐ转录起始位点上游２０７５ｂｐ启动子序列。生物信息学分析发现该序列中存在４个ｓｐ１结合位点和１个ｃｐｇ岛。将启动子序列构建到ｐｇｌ３－ｂａｓｉｃ的双荧光素酶报告基因载体上，再利用ｒｎａ干扰技术分析转录因子ｓｐ１对ｓｋｉｐ转录的影响。荧光素酶活性分析发现ｓｐ１的表达抑制使成肌细胞中ｓｋｉｐ启动子活性显著下降，表明转录因子ｓｐ１可能通过顺式作用元件ｇｃ－bｏｘ对成肌细胞分化过程中ｓｋｉｐ基因的转录激活起正向调控作用。关键词：ｓｐ１；猪；ｓｋｉｐ；启动子活性；ｒｎａ干扰ａｂｓｔｒａｃｔ：ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅｐｒｏｘｉｍａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｓｋｉｐ．ａｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ２０７５ｂｐｕｐｓｔｒｅａｍｓｔａｒｔｃｏｄｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｇｅｎｏｍｉｃｄｎａｏｆｐｏｒｃｉｎｅ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｉｔｈａｄ４ｓｐ１ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓａｎｄｏｎｅｃｐｇｉｓｌａｎｄ．tｈｅｃｌｏｎｅｄｓｋｉｐｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｐｇｌ３－ｂａｓｉｃｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｐ１ｏｎｓｋｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｒｎａｉｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄａｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｓｋｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙthroughｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｐ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｃ２ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔｓ．ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｐ１ｐｌａｙｅｄａｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｉｎｓｋｉｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｏｓｓｉｂｌｙｂｙｇｃｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｍｙｏｔｕｂｅｓ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｐ１；ｐｏｒｃｉｎｅ；ｓｋｉｐ；ｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｒｎａｉinterference骨骼肌纤维是骨骼肌的主要组成部分，肌纤维的数量和大小直接影响家畜的胴体性状，与遗传因素相关。５′肌醇磷酸酶（ｓｋｉｐ）由ｉｊｕｉｎ等［１］首先发现并分离，在各组织中广泛表达，尤其在心脏、骨骼肌和肾脏中高表达，因此ｓｋｉｐ被称为骨骼肌和肾脏富含的５′肌醇磷酸酶。通过人与猪比较图谱，发现猪的ｓｋｉｐ定位在猪１２号染色体ｓｓｃ１２ｑ１．３上。其所在位置存在影响第１０肋骨背膘厚、胴体长［２］、肌纤维数量［３］和大腿重［４］的ｑｔｌ区域。运用牛基因图谱信息，发现牛ｓｋｉｐ定位在１９号染色体ｂｔａ１９ｑ１．３上，其所在位置存在影响犊牛出生重［５］的ｑｔｌ区域。ｓｋｉｐ杂合突变小鼠比目鱼肌和股四头肌的重量显著提高［６］也印证ｓｋｉｐ具有调节骨骼肌纤维发育的功能。因此有必要进一步研究该基因参与骨骼肌生长发育的表达调控机制，为弄清楚肌纤维的生长发育规律奠定基础。１材料与方法１．１材料限制性内切酶、ｔ４连接酶、反转录试剂盒等购自ｆｅｒｍｅｎｔａｓ－ｍｂｉ公司；ｔａｑｄｎａ聚合酶、ｓｙｂｒｇｒｅｅｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｍａｓｔｅｒｍｉｘ、ｄｎｔｐ、ｄｎａ分子质量标准ｄｌ２０００、ｐｇｌ３－ｂａｓｉｃ载体等购自全式金生物公司；染色体步移试剂盒购自ｃｌｏｔｅｃｈ公司；双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自ｐｒｏｍｅｇａ公司。１．２步移引物设计和ｐｃｒ扩增根据猪ｓｋｉｐ第一外显子序列，采用ｐｒｉｍｅｒ５．０设计步移巢式引物，如表１，引物由北京奥科生物技术有限公司合成。步移扩增由两轮ｐｃｒ反应组成。第一轮ｐｃｒ反应体积为５０μｌ，反应体系为５μｌ１０×ｂｕｆｆｅｒ，１μｌｄｎｔｐ（１０ｍｍｏｌ／ｌ），１μｌ引物ａｐ１和第一轮ｐｃｒ特异引物，１μｌ文库ｄｎａ模版，去离子水补足至５０μｌ，离心混匀。第一轮ｐｃｒ反应条件为：９４℃５ｍｉｎ后迅速加入ｔａｑ酶１μｌ；９４℃２５ｓ，７２℃３ｍｉｎ，７个循环；然后９４℃２５ｓ，６７℃３ｍｉｎ，３２个循环；６７℃７ｍｉｎ。取５μｌ第一轮ｐｃｒ产物，在１．５％的琼脂糖中电泳检测。确认后继续第二轮ｐｃｒ反应。除了模板、引物改变外，第二轮ｐｃｒ反应体系与第一轮相同。将１μｌ第一轮ｐｃｒ产物（包括阳性和阴性对照）稀释５０倍，取其中１μｌ作为第二轮ｐｃｒ反应的模板，引物为ａｐ２和第二轮ｐｃｒ特异引物。第二轮ｐｃｒ反应条件为：９４℃预变性１０ｍｉｎ；９４℃变性２５ｓ，７２℃３ｍｉｎ，５个循环；９４℃变性２５ｓ，６２℃３ｍｉｎ，２０个循环；６７℃延伸７ｍｉｎ。取５μｌ产物，在１．５％的琼脂糖凝胶中电泳。１．３生物信息学分析在线网站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ｔｆｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ分析基因启动子区的转录因子结合元件，ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ１．ｈｔｍｌ）预测基因启动子区是否有ｃｐｇ岛。１．４猪ｓｋｉｐ启动子表达载体的构建根据ｐｇｌ３－ｂａｓｉｃ载体的多克隆位点和猪ｓｋｉｐ的启动子序列，设计包含ｓａｃⅰ酶切位点的正向引物ｐ１ｆ：５′-ａａａｇａｇｃｔｃａｃｔｃｔｔｇｔｔｇａｔｇｔｇｇｃｔｔｇａ-３′和ｘｈｏⅰ酶切位点的反向引物ｐｒ：５′-ｃｃｃｔｃｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔｃｇｇｔｃｔ-３′，以猪基因组ｄｎａ为模板进行ｐｃｒ扩增。直接将符合目的片段大小的ｐｃｒ产物用限制性内切酶ｓａｃⅰ和ｘｈｏⅰ双酶切，３７℃过夜。将ｓａｃⅰ和ｘｈｏⅰ双酶切的线性化ｐｇｌ３－bａｓｉｃ载体与目的片段按照１∶３摩尔比均匀混合，用ｔ４连接酶连接，然后转化大肠杆菌ｄｈ５α。１．５化学合成ｓｐ１－ｓｉｒｎａｓ根据在线软件ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／ｄｅｓｉｇｎ．ｄｏ设计化学合成的ｓｉｒｎａ靶序列，见表２。１．５实时定量ｐｃｒ在ｓｐ１－ｓｉｒｎａｓ转染ｃ２ｃ１２细胞６ｈ后用２％马血清诱导细胞分化，于分化第三天提取细胞ｒｎａ。ｐｃｒ反应体系：ｓｙｂｒｇｒｅｅｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｍａｓｔｅｒｍｉｘ１２．５μｌ，定量引物０．５μｍｏｌ／ｌ，ｃｄｎａ模板５００ｎｇ，补去离子水至总体积为２５μｌ。ｐｃｒ扩增程序：９５℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性２０ｓ，５８℃退火２０ｓ，７２℃延伸３５ｓ，７４℃读板，４０个循环，每个样３个重复。ｐｃｒ反应的特异性通过产物溶解曲线确认。用ｂｉｏｒａｄ公司的ｉｑ５软件分析结果。先将阈值选定在各对数扩增曲线平行上升的最低点，得到各管的ｃｔ值。软件会算出每个基因ｃｔ值的平均数及标准差和每组特异基因相对于内参的表达量。应用spss１３．０软件的单因素方差方法分析不同处理组中基因的表达是否具有显著差异，ｐ＜０．０５为具有显著性差异。１．６启动子的荧光素酶活性分析在重组载体和ｓｐ１－ｓｉｒｎａ共转染ｃ２ｃ１２细胞２４ｈ后，小心吸弃培养基，ｐｂｓ洗２次。２００μｌ／孔的ｐａｓｓｉｖｅｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ滴加到２４孔板的每孔细胞中，在室温避光裂解１５ｍｉｎ。置振荡器振荡３０ｓ，将裂解完全的细胞裂解液收集到１．５ｍｌｅｐ管中，－８０℃贮存备用。检测前先在室温中平衡细胞裂解混合液，每个样品取１０μｌ到黑色９６孔酶标板中摇匀，使细胞裂解液均匀铺满底部。提前３０ｍｉｎ预热报告基因检测仪。将样品、工作液依次放入到检测仪器内，设置好程序后开始检测，每个样品将会有２个荧光素酶报告值ａ和ｂ，ａ值与ｂ值的比值就是每个样品的相对表达量。２结果与分析２．１猪ｓｋｉｐ启动子的克隆根据猪ｓｋｉｐ第一外显子序列，设计２条特异的ｐｃｒ引物，分别为ｆｇｐｓ１和ｆｇｐｓ２。以４个不同酶切的基因组步移库为模板，以ｆｇｐｓ１和ａｐ１（ａｄａｐｔｏｒｐｒｉｍｅｒ１）配对进行第一轮ｐｃｒ反应。将第一轮ｐｃｒ反应产物用去离子水稀释50倍后作为第二轮ｐｃｒ反应的模板，将引物ｆｇｐｓ２与ａｐ２（ｎｅｓｔｅｄａｄａｐｔｏｒｐｒｉｍｅｒ２）组合进行第二轮ｐｃｒ扩增。扩增结果电泳检测，第一轮ｐｃｒ反应的产物均呈弥散带（图１－ａ）；第二轮ｐｃｒ产物中，经ｐｖｕⅱ消化后的基因组为模板扩增出大小约３２８ｂｐ的片段，电泳检测结果如图１－ｂ所示。根据第一次ｐｃｒ步移得到ｓｋｉｐ启动子序列，设计了另一对嵌套特异引物ｓｇｐｓ１和ｓｇｐｓ２对ｓｋｉｐ进行第二次步移。同样以４个不同酶切的基因组步移库为模板，引物ｓｇｐｓ１与ａｐ１组合进行第一轮ｐｃｒ扩增（图２－ａ），以ｓｇｐｓ２和ａｐ２为巢式引物进行第二轮ｐｃｒ扩增（图２－ｂ）。在第二轮ｐｃｒ产物中，经ｄｒａⅰ消化后的基因组为模板扩增出大小约８７１ｂｐ的片段（泳道４）。鉴于扩增片段长度偏短，再根据第二次ｐｃｒ步移得到ｓｋｉｐ启动子序列，又设计了一对嵌套特异引物ｔｇｐｓ１和ｔｇｐｓ２对ｓｋｉｐ进行第三次步移。继续以四个不同酶切的基因组步移库为模板，引物ｔｇｐｓ１与ａｐ１组合进行第一轮ｐｃｒ扩增（图３－ａ），以ｔｇｐｓ２和ａｐ２为巢式引物进行第二轮ｐｃｒ扩增（图３－ｂ）。在第二轮ｐｃｒ产物中，经ｅｃｏｒｖ消化后的基因组为模板扩增出约１１８２ｂｐ的片段（泳道４）。将３次基因组步移所得到的序列拼接起来，得到猪ｓｋｉｐ部分启动子序列。２．２启动子序列分析将３次基因组步移拼接得到的猪ｓｋｉｐ启动子区序列利用在线软件ｔｆｓｅａｒｃｈ预测分析启动子中的潜在顺式作用元件，发现３个潜在的ｔａｔａｂｏｘ，２个ｍｙｏｄ结合位点，４个ｓｐ１结合位点和１个位于起始密码子上游的ｃｐｇ岛，如图４所示，而４个ｓｐ１结合位点都处于ｃｐｇ岛中。为了阐明ｓｋｉｐ的表达调控机制，将２０７５ｂｐ的启动子序列片段（－２０３８到＋３７）克隆到ｐｇｌ３载体中命名为ｐ１，酶切鉴定如图５。２．３ｓｐ１－ｓｉｒｎａ的合成和干扰效果为了深入了解ｓｐ１对肌细胞分化过程中ｓｋｉｐ转录的影响，用化学合成的方法合成ｓｐ１的干扰序列ｓｐ１－ｓｉｒｎａｓ，化学合成的ｓｐ１－ｓｉｒｎａｓ转染分化中的肌细胞的实时定量分析如图６所示。实时定量ｐｃｒ结果显示，ｓｐ１和β－ａｃｔｉｎ标准曲线制备均在线性范围内，扩增产物溶解曲线符合要求。ｓｐ１的ｍｒｎａ表达量在各试验组及对照组中整体水平差异显著（ｐ＜０．０５）。３个ｓｐ１－ｓｉｒｎａ在肌细胞中均抑制ｓｐ１的表达，其中ｓｐ１－ｓｉｒｎａ２抑制率最高。２．４ｓｐ2-ｓｉｒｎａ２表达抑制对肌细胞分化和ｓｋｉｐ启动子活性的影响由图7可知，ｓｐ2－ｓｉｒｎａ２显著降低了ｍｈｃ和ｔｎｔ的表达，抑制了肌细胞的终末分化。利用ｓｐ１-ｓｉｒｎａ２与启动子ｐ１共转染肌细胞分析ｓｐ１对肌细胞中ｓｋｉｐ表达的影响。荧光素酶活性分析表明ｓｐ１受到干扰时，ｓｋｉｐ启动子的活性也显著下降了（图８）。表明转录因子ｓｐ１可能通过顺式作用元件ｇｃ－bｏｘ对肌肉细胞分化过程中ｓｋｉｐ的转录激活起正向调控作用。３讨论有研究发现，脊椎动物基因组包含未甲基化的ｃｐｇ岛［７］。虽然不清楚这些区域是怎么维持非甲基化状态的，但是在有些情况下这依赖于转录因子ｓｐ１的结合［８］。ｓｐ１是较早克隆和鉴定出的结合在ｓｖ４０启动子上的真核转录因子［９］。它包含３个锌指结构基序，ｃｙｓ-２-ｈｉｓ-２，能结合在ｇｇｇｇｃｇｇｇｇ序列上［１０］。ｓｐ１结合位点经常在ｃｐｇ岛区出现。有研究发现ｓｐ１结合位点对维持ａｐｒｔ基因ｃｐｇ岛的非甲基化状态十分关键［１１］。预测发现位于转录起始位点上游的１个ｃｐｇ岛区域和若干ｓｐ１结合位点，推测ｓｐ１转录因子可能是调节ｓｋｉｐ稳定表达的潜在转录因子。如果没有ｓｐ１结合位点遍布ｃｐｇ岛区，则ｓｋｉｐ启动子很容易被甲基化引起转录活性的抑制，但是５′肌醇磷酸酶ｓｋｉｐ是广泛表达且在某些组织是高表达的，暗示转录因子ｓｐ１可能避免基因