家畜繁殖学实验

《动物繁殖学》实验动物科学2009级授课教师：何兰花2009年9月实验须知1、实验前，必须认真预习实验指导书，了解实验目的、原理和方法。2、严格按照实验操作规程及有关要求进行实验，独立完成各项操作，作好实验记录，依时缴交实验报告。3、爱护公物，小心使用各种仪器设备，如有丢失、损坏，应立即向老师汇报，并如实在实验室的记事本上登记；节约使用实验材料、药品以及水电，避免浪费，并注意使用药物时滴管一定要专用，用完后立即放会原来的药瓶以避免污染。4、保持良好的实验秩序，保持安静，保持实验室整齐清洁，废弃物品丢入指定容器。实验完毕清理（洗）仪器用具，并放回原位，整理桌面，把凳子拿到墙边排号，经上课教师检查同意方可离开。值日生打扫地面，关好水电门窗。5、注意安全，勿踏地上电线和开关、插头，不可随便动与本实验无关的仪器。6、上课时间要求穿白大褂，不准穿拖鞋入实验室。目录实验一人工授精器材的配置认识及假阴道的安装调试第7周实验二睾丸、卵巢的组织学切片观察第9周实验三精液品质的常规检查及理化因素对精子的影响第11周实验四精子数量计数和畸形率的测定第13周实验五不同畜种精液稀释液的优化第15周星期三5-6节（7、9、11、13、15周）动科2009（2）动物繁殖学（25人）星期三7-8节（7、9、11、13、15周）动科2009（1）动物繁殖学（28人）星期四5-6节（7、9、11、13、15周）动科2009（3）动物繁殖学（28人）实验一人工授精器材的配置认识及假阴道的安装调试[实验目的]1．熟悉家畜人工授精所使用的各种器械，了解其用途、构造和使用方法。2．掌握假阴道的安装步骤和方法。[实验内容]介绍家畜人工授精的主要器材以及假阴道的安装步骤和方法。[实验仪器、设备及材料]1．消毒用具高压蒸汽灭菌器、煮沸消毒器、酒精灯、紫外线灯。2．采精用具各种家畜假阴道、假台畜、温度计、玻璃棒、润滑剂、长柄钳等。3．精液品质检查用具量精杯、显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温盘）、血球计数室（在显微镜下找出）、酸度计、烧杯、载玻片、盖玻片、玻棒等。4．配制稀释液用具及运输、保存精液容器量筒、天平、药匙、漏斗架、滤纸、冰箱、广口保温瓶、贮精瓶。5．输精用具各种家畜输精器、阴道扩张器、头灯或手电筒、长臂手套等。6．精液冷冻设备液氮机、液氮罐、精液冷冻器械（制颗粒冻精盒）、细管精液制备机等。7．一般用品玻棒、毛巾、棉花、纱布、玻璃瓶、标签、瓷盘、水桶、肥皂、工作服等。8．常用药品酒精、新洁尔灭、稀释液用药品、白凡士林、染色剂、蒸馏水等。[实验步骤]一、人工授精器械的结构和组成1．假阴道的结构和组成（1）牛、羊用假阴道（各种家畜采精用的假阴道主要由外壳、内胎、集精杯、活塞、固定圈等部件组成。）牛、羊假阴道的构造基本相同，唯羊用假阴道较短小。外壳系用硬橡胶或硬质塑料制成的圆筒，中部有一注水孔，可注入热水并通过气门活塞进行充气。内胎由优质橡胶制成，装入外壳内，两端翻卷固定在外壳上，加固定圈固定之，在假阴道的一端安装上集精杯。（目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激。）集精杯有两种：一种是夹层棕色玻璃集精杯，夹层可盛35℃左右的温水以保护精子免受低温打击，外面用专用的集精杯固定套固定。另一种是在橡胶漏斗上接上一个有刻度的玻璃管，连同假阴道－并装入人造革保温套内。（2）猪用假阴道猪用假阴道的外形和构造基本上与牛、羊假阴道相同。不同的是较牛假阴道短些，集精瓶为350-500ml棕色有刻度的广口玻璃瓶，用乳胶漏斗固定在假阴道外口上。在生产实践中，猪通常用手握法采精，只需备一只医用乳胶手套和一个收集精液的保温杯。2．输精器械输精器械主要为扩张器、输精管和照明灯。扩张器有两种，一种是鸭嘴式（金属），另一种是圆筒式（玻璃或塑料），各种家畜的扩张器只是大小上的区别。输精器有玻璃、金属、塑料、橡皮制成的。马、猪的输精器，为一端尖细的优质橡皮管，马的较粗和长，猪的细和短，输精管的一端接注射器。牛、羊的输精器是由金属或玻璃制成的输精管，其后连接一个橡皮球或注射器。牛的输精器比羊的粗和长。牛多采用直肠把握法输精，所采用的输精器多为金属输精器。细管冷冻精液输精枪由金属外壳、推杆以及一次性塑料外套组成，每次配种后更换新的一次性塑料外套即可，不需要消毒就可连续使用。使用时将细管的封口一端剪去，将另一端插在输精枪的推杆上，推动椎杆，借助细管中的封闭塞即可将溶解后的精液排出。3．冷冻精液设备（1）冷源（常用冷源为液氮、干冰）液态氮是利用空气分离设备-液氮机，将空气重复压缩、膨胀、冷却、液化后呈透明状的液化空气。再将液化空气进一步冷却，即可分离成为液化氮、液化氧和液化氩。液氮的温度为-196℃。（2）冷冻精液保存容器保存冷冻精液的专用容器为液氮容器。液氮是超低温的液化气体，吸热后易气化，所以液氮必须保存在专用的液氮容器内，贮氮容器有：杜瓦瓶、贮氮罐、贮氮槽、贮氮车和贮精罐等。大型容器可贮数千升液氮，小的可容数十升，最小的不到1L。保存冷冻精液常用的是中、小型液氮罐。是由耐腐蚀和防锈的铝合金制成。外层称为外壳，上有罐口、手柄及密封的抽气孔。内层亦为金属制成的瓶罐。在罐颈处是以铝合金相同热膨胀系数的玻璃钢，用低温粘合剂牢固粘在一起。液氮罐采用高真空和多层绝热的结构形式进行绝热。容器的内、外层之间抽空形成6666Pa（50mmHg）的高度真空，并放置有适量的、经过真空干燥处理的低温吸附剂和常温吸附剂。在有效期内，对于容器材料的放气及漏进容器的活性气体（N2、O2、CO2等）几乎全部吸收，从而维持容器的真空度。罐塞是由塑料制成并留有空隙，以保证排出氮气通畅，保障液氮罐的安全使用。在罐颈处可以固定数个提筒用于贮存精液。液氮罐因不同容量而有不同型号。（3）冷冻精液类型颗粒型：将精液在液氮降温的冷冻板上滴冻成0.1ml左右的丸剂，待用解冻液溶解后，用一般人工授精输精器输精。安瓿型：将精液分装于安瓿中，在液氮蒸气中冻结。加热溶解后用一般人工授精器输精。细管型：将精液分装于0.5ml或0.25ml的细塑料管内，经液氮蒸气冻结，加热溶解后，用专用的细管精液输精器输精。（要有专用机器才能制细管冻精）4．高压灭菌器高压灭菌器系由合金制成，轻便耐用，适用于少量物品灭菌，因此为人工授精站广泛采用。其主要构造为器身、器盖及器内的安置桶所组成，盖上附有压力表、安全阀门与放气软管，在安置桶壁设有一小筒，用以插入放气软管，桶底面有多孔的隔板。使用时先在灭菌器内放入2500-3000ml的清水，再将盛有需灭菌的各种人工授精器械、物品的安置桶放入器身内，合上气盖，同时注意将放气管插入安置桶壁的小筒内，将锁紧螺丝扭紧，使气盖平稳、牢固地密合以免漏气。然后将灭菌器置于火炉上加热，此时可将放气阀门的手柄直立，待灭菌器内的空气排尽而有白色蒸汽冒出时再关闭阀门。或者待压力表指针升至49.03kPa左右时打开放气阀门以排放空气，当空气排尽而有白色蒸汽冒出时再关闭阀门，并继续向灭菌器加热。灭菌器的压力要求维持在68.65kPa（温度为115℃）经30分钟，或98.07kPa（温度为120℃）经20分钟。灭菌完毕后，等待压力表指针下降至零度时，将放气阀门打开，放尽灭菌器中的蒸汽，趁热打开灭菌器，取出各种物品备用。[消毒器械和稀释液时，要求灭菌器压力维持在0.7kg／cm2（器内温度为115℃）经30min消毒。若只消毒器械，可维持1.0kg／cm2（温度120℃）经20min即可。]5．在显微镜下找出血球计数室每块血球计数板有上下两个计数室，使用时物镜只须对准其中1个就行。每个计数室面积为1mm2，深为0.1mm，由25个大方格构成（双线），每个大方格又分为16个小方格。（注意光线为暗视野且光线方向不要与竖线相同。）二、假阴道的安装1．安装前的检查工作（1）假阴道外壳是否有裂缝或小孔。（2）假阴道内胎是否漏气、内胎的光滑面应为内壁，边缘是否有裂损。（3）气门活塞是否完好或漏气、扭动是否灵活。2．安装方法（1）内胎的安装将假阴道内胎装入外壳中，光滑面应朝向内腔。内胎露出外壳两端长短应相等，将假阴道外壳夹在安装者的大腿之间，使内胎的两端翻卷于外壳两端上，内胎应平整不得扭曲，内胎的中轴应与外壳中轴重合，即内胎和外壳的两端应成为同心圆位置，用橡皮圈将两端扎紧。（2）消毒先用长柄钳夹取75％酒精棉球擦拭消毒内胎和集精杯，再以95%的酒精棉球擦拭，待酒精挥发干燥后方可用于采精，采精前用稀释液冲洗1-2次。（3）集精杯的安装装上集精杯，外加集精杯保护套。（4）涂润滑剂用消毒玻棒取适量灭菌凡士林与石蜡油的混合物，均匀地涂于内胎腔的前1／2段（与阴茎接触部分）的表面，以利于采精时阴茎导入。（5）注水从注水孔向假阴道夹层内注入50-55℃的温水，使其能在采精时的温度保持38-40℃。注水量为夹层容积的1/3~1/2（牛约500ml左右），装上气门活塞。（6）调节假阴道内腔压力打开气门活塞，吹入适量空气，使内胎一端的中央形成“Y”形。（7）测量内腔温度用消毒的温度计插入假阴道内腔，待温度不变时再读数，一般温度为38-40℃。（8）防尘用消毒毛巾盖住假阴道的开口端，以备采精。[实验注意事项]1．安装者的指甲须剪短，以免将内胎掐破。2．安装好的假阴道须稳妥平置，勿碰及其他硬物，以免损伤内胎。[思考题]1.各种公畜采精器械的设计原理及优缺点是什么？2.试述牛假阴道的组成和安装时要求；进行采精时应具备哪些条件？实验二睾丸、卵巢的组织学切片观察[实验目的]1.通过观察家畜睾丸和卵巢组织切片，了解家畜睾丸、卵巢的组织结构及其形态。2.掌握精子的发生和卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态。[实验仪器、设备及材料]1.材料公畜睾丸，母畜卵巢组织切片及挂图2.器械显微镜、投影仪。[实验步骤]一、睾丸的组织学观察教师先结合投影仪进行讲解，使学生对公畜睾丸、母畜卵巢组织学结构及精子发生、卵泡发育过程有了初步的了解。然后再用显微镜观察睾丸、卵巢组织切片。1．低倍镜观察①被膜：由浆膜和白膜构成。外层浆膜为一较薄的固有鞘膜，从腹膜延伸而来。内层的白膜为弹性结缔组织构成的、致密的、白色薄膜层，其中含有丰富有血管。白膜下为实质部分，即睾丸的功能层。②睾丸纵隔和中隔：睾丸纵隔为睾丸白膜从睾丸头伸向睾丸实质的结缔组织索，并向四周发出许多放射状的结缔组织小梁，伸向白膜。这些结缔组织小梁称为睾丸中隔。猪的睾丸中隔较发达，牛、羊的薄而不完整。③睾丸小叶：由睾丸中隔将睾丸实质分成许多基部朝向、顶端向内的锥形小叶，每个小叶由2-3条盘曲的曲精细管及血管和间质细胞组成。曲精细管直径约200μm。据估测，牛的曲精细管拉直，头对头连接，可长达几千米，站睾丸重量的80%。④附睾：曲精细管在各小叶的尖端先各自汇合成直精细管，穿入睾丸纵隔结缔组织内，形成弯曲的导管网，称为睾丸网（马无此结构），为精细管的收集管道。睾丸网又分出12～15条睾丸输出管，汇入附睾头形成附睾管，经附睾体、附睾尾最后过渡为输精管。2．高倍镜观察观察睾丸小叶的结构和睾丸小叶中精细管及间质细胞的结构和形态。观察精子在发生周期中主要阶段和支持细胞形态。①睾丸小叶的结构：有曲精细管及其间质细胞构成。此外，还有血管、淋巴管等。②间质细胞：又称Leyding细胞。体积较大，分布于曲精细管之间，近似卵圆形或多角形，胞质嗜酸性，核大而圆，具有分泌雄激素的功能。③曲精细管的结构：曲精细管的管壁自外向内由同心圆状排列的结缔组织、基膜和复层上皮构成。上皮细胞成层地排列在基膜上，可分为生精细胞和支持细胞两种。④支持细胞：又称Sertoli（塞托利氏）细胞或足细胞。体积较大而细长，数量较少，为高柱状或锥状细胞，属于体细胞。呈辐射状排列在曲精细管中，其侧面嵌含各个发育阶段的生殖细胞之间，其底部附着在曲精细管的基膜上，游离端一直伸达精细管的管腔，常嵌含有许多精子。该细胞高低不等，界限不清，细胞核较大，位于细胞的基部，着色较浅，核仁明显，但不显示分裂现象。由于它的顶端有数个精子伸入胞浆内，故一般认为此种细胞是对生精细胞起着支持、营养、保护等作用。足细胞失去功能，精子