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细胞培养基本技术概述细胞的原代培养原代细胞培养原理细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污原代细胞培养操作切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清（或离心，800－1000转／分，5分钟）原代细胞培养操作组织块培养法：用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，翻转培养瓶，加入2－3ml培养液，培养4－5h后，待组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转培养瓶，静置培养3天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，10－15d可长成单层，此时，可传代培养。原代细胞培养操作消化法：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿出反复吹打，加入培养液终止消化。过滤。离心，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入3－5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，计数，细胞浓度为5×105,移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养血细胞记数板血细胞计数板的构造细胞计数区：四个角得大方格16个中格（4＊4）原则：计左不计右，计上不计下，防止重复计数。公式（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104说明：公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3消化培养法的主要过程原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层贴壁细胞的生长规律贴壁过程传代细胞培养原理培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次培养细胞一代生长过程（一）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（24-96h）连续细胞系时间短（10-30min）（二）指数生长期：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，可对细胞进行各种实验指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（三）停滞期：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞的传代培养操作1、悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代2、贴壁细胞（重点）贴壁细胞传代培养过程1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作台准备、实际预温、操作人员准备。2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。刚加入合适过头4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。6、观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。注意事项1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。3、消化时间的掌握哺乳动物细胞冷冻保存冷冻保存要点冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。冷冻过程要缓慢。4℃30－60分钟→-20℃30分钟→-80℃16－18小时（或过夜）→液氮长期保存常用细胞冷冻保存液10％DMSO＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中解冻冷冻保存细胞的离心方法从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻将1－2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀离心2－3分钟，弃上清液用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。细胞培养常见问题解答培养液pH值变化太快•培养瓶盖拧得太紧–松开瓶盖1/4圈•NaHCO3缓冲系统缓冲力不足–加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度•细菌、酵母或真菌污染–丢弃培养物或用抗生素除菌培养液出现沉淀，但pH值不变•用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来–用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌•冰冻保存培养液–将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液培养液出现沉淀，同时pH发生变化•细菌或真菌污染–丢弃培养物–抗生素除菌培养细胞不贴壁•胰蛋白酶消化过度–缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度•支原体污染–分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物•培养液中无贴壁因子原代细胞培养物污染•原代培养组织在进入培养前已污染–培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织培养细胞生长减慢•由于更换不同培养液或血清–比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验–增加起始培养细胞浓度•培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏–让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子•培养物中有少量细菌或真菌污染–用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。•试剂保存不当–血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2－8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完何时须更换培养基？•视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？•欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？•除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？•不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？•直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？•培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。细胞培养的污染和检测•细胞污染的种类细菌、酵母菌、霉菌和病毒•污染源无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之细胞细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。白色念珠菌污染真菌感染支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状细菌和真菌的污染和检测•肉眼直接观察法•培养检查法•显微镜观察法支原体的污染和检测•Hayflick培养基直接培养法•DNA荧光染色法•PCR方法•相差显微镜观察法•测出细胞株有支原体污染时，应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。