柱层析技术

柱层析技术的讨论1.基本原理及分类2.常用吸附剂3.流动相体系4.层析柱的选择5.基本操作和注意事项基本原理色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。塔板理论基于热力学的塔板理论它是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。塔板理论理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。塔板理论塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。分类柱层析方法分类：吸附色谱柱：吸附剂，洗脱剂（流动相）；分配色谱柱（萃取原理）：载体，固定相，流动相；离子交换树脂柱；凝胶柱吸附色谱柱较为常用，下面重点讨论吸附剂硅胶中性、酸性，比较适合分离中性或酸性物质粒度100~200目，200~300目，300~400目，更高氧化铝酸性，适合分离酸性物质中性，pH值7.5，适合分离碱性物质碱性，pH值10，适合分离碱性物质聚酰胺硅藻土活性炭吸附剂的选择中性、酸性物质优先试用硅胶分离，如果效果不好可以使用氧化铝碱性物质也可以使用硅胶分离，但需要用三乙胺等碱性物质碱化吸附剂如果选择氧化铝分离，需要使用氧化铝TLC板点板，使用硅胶板不能准确选择流动相体系吸附剂的选择吸附剂目数的选择对于Rf值0.4的杂质，可以选择目数100~200的硅胶对于Rf值在0.2~0.4的，一般用200~300目对于Rf值在0.1~0.2的，用300~400目对于Rf值0.1的，需要更多的吸附剂用量、较小的流动相体系、较长的时间吸附剂的选择吸附剂的量的选择一般为5~40倍常用的为10~20倍由流动相体系、吸附剂目数综合决定。流动相体系正己烷和石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统（有时样品溶解性差的可以加入二氯甲烷）极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统流动相体系的选择首先从待分离物质的结构上判断1.极性基团较多的，如胺基、羧基，选择极性较大的体系。一般为甲醇：氯仿体系2.可形成氢键部位较多的，应选择极性较大的流动相体系3.脂溶性集团较多的，一般乙酸乙酯：石油醚体系就可以流动相体系的选择可替换的流动相体系考虑到物质的溶解性和极性变化，上述流动相体系还可以做一些变化：乙酸乙酯：石油醚—丙酮：石油醚—二氯甲烷:(乙酸乙酯)：石油醚—乙酸乙酯：正己烷（价格贵不推荐）甲醇：氯仿—甲醇：二氯甲烷—乙醇：二氯甲烷比如，有的物质在乙酸乙酯里溶解度很差，上柱后样品不能有效的溶解在流动相中，影响分离，可以改用丙酮、二氯甲烷、或者三种溶剂同时混合使用比如，使用甲醇：二氯甲烷体系极性较大时，可以改换乙醇：二氯甲烷体系，就可能得到较好的分离效果流动相体系的选择由TLC实验数据推断柱层析流动相配比：在选择一定的流动相的前提下，调整流动相组分或比例，使目标物的Rf值为0.5，与邻近杂质的分离度至少在0.1以上（当然是越大越好，Rf达到0.2~0.3就很容易分离了）根据所选的吸附剂的目数因为TLC是高效板，硅胶柱的分离效果较差，所以一般需要在TLC流动相的基础上放大5~10倍，甚至更多才可以得到相似的分离度流动相体系的选择特殊样品：会造成拖尾，严重影响分离效果碱性物质先用千分之一到百分之一的氨水、三乙胺或者氨甲醇，碱化柱子酸性物质洗脱剂中加千分之一的醋酸，或苯磺酸层析柱的选择关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好：横截面/高度比根据待分离的样品的量进行选择：装柱太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好，同时浪费时间，不稳定的物质还可能会变质。AB基本操作程序清洗砂芯，检查柱子装柱：干法，湿法上样：干法，湿法洗脱：根据TLC情况配置洗脱液收集：检测方法选择使用常压或减压蒸馏，冻干等方法除去溶剂装柱干法直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用洗脱剂“走柱子”，一般洗脱剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。湿法：先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。上样干法：把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶（一般是样品的1~2倍量），拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。而且适用于溶解性差的样品，使用湿法则需要较多的溶剂，导致上样层变厚湿法湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。优点：简便洗脱与收集考虑三因素：溶解性，亲和力，分离度（Rf值）固定比例洗脱剂；梯度洗脱如何设定洗脱剂的比例：硅胶的粒度；样品层/空白柱层高度比：1:5~1:40；在TLC上目标物Rf值为0.5的流动相；预计的分离时间。——决定了在TLC展开剂的基础上放大的倍数常压、加压、减压适当的检测方法的选择：UV，HPLC，适当的显色剂柱层析的小试到放大横截面与高度比：保证适当的塔板数装柱的紧密度流速的计算一般的策略目标产物与杂质Rf值相差较大(0.2)的样品小目数吸附剂，较大极性，快速搞定目标产物与杂质Rf值相差很小（0.1~0.2）难以分离的样品增加吸附剂的目数和用量，减小洗脱极性，延长洗脱时间；或者先进行粗分，除去容易出去的杂质，再二次层析制备色谱分离：制备高效液相，Biotage自动柱层析仪对映异构体的分离：朱景松的例子，或者使用制备SFC（超临界色谱）分离实战举例非那雄胺不合格产品，杂质B相对保留时间1.16TLC实验丙酮：石油醚=1：4，目标物与杂质B的Rf值相差0.2实际操作粗品1kg，装柱160~200目硅胶25kg流动相丙酮：石油醚（1：40）NHOOHNNHOOHN非那雄胺杂质B制备板分离原理同TLC制备板：吸附剂GF2540.3~0.4mm载样量100mg操作流程将样品溶解，用0.5或0.9mm毛细管将样品均匀的点在板的下方，吹干溶剂，放入展缸展开。显色或UV确定所要色带，将所需要的色带用小刀刮下，硅胶用溶解性好的溶剂浸泡，过滤，浓缩，即可得到产物。优点：与TLC板情况比较吻合，操作简便点样处展开方向