环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌摘要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61℃,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu/mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。简介：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌,在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin—resistantStaphylococcusaureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR法等。环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫病、沙门氏菌、虾中的白斑综合症病毒、志贺氏菌属和大肠杆菌。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套LAMP引物,对金黄色葡萄球菌进行检测,优化反应条件,确定检测特异性,对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比。LAMP的技术原理：LAMP方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(60～65℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到10^9～10^10个拷贝。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。材料与方法1.材料与仪器材料：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonellaenterica)、沙门氏菌(Salmonellasp)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，沙门氏菌(SalmonellaHJ-004)、志贺菌(Shigellaspp)、单增李斯特菌(Listeriammonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)ETEC:44247(6:15:16)、EPEC:44706(111:58)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(StreptococcusthermophilusKLDS)、双歧杆菌(LactobacillusbifidusKLDS)，BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)、DNAmarkerDL2000仪器：DYY-10C型电泳仪UVP凝胶成像仪2.实验方法⑴DNA模板的制备煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取1mL于EP管中12000r/min,离心5min收集菌体,加入TE-Trinton200μL混匀后,于沸水中5min,后12000r/min离心5min,取上面50μL作为LAMP扩增及PCR扩增反应的模板。另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNA备用。⑵引物的设计与合成根据金黄色葡萄球菌femA基因,应用PrimerExplorer3设计特异引物,包括两条外引物F3、B3,内引物FIP、BIP。⑶LAMP反应及条件的优化①LAMP反应：配置反应体系为25μL,包括:018mmol/LFIP,018mmol/LBIP,012mmol/LF3,012mmol/LB3,116mmol/LdNTPs,018mmol/Lbetaine,4mmol/LMgSO4,20mmol/LTris-HCl(pH818),10mmol/LKCl,10mmol/L(NH4)2SO4,2μLDNA模板,混匀。95℃,5min,然后冰浴5min。加入8UBstDNA聚合酶,于65℃扩增1h,80℃灭活10min,产物于210%琼脂糖凝胶电泳检测。②反应条件的优化：分别改变反应温度、Mg2+浓度LAMP扩增,电泳观察扩增产物,确定最适的反应条件。③特异性实验：用建立的LAMP方法扩增大肠杆菌、沙门氏菌等其他18株菌株,电泳观察扩增产物,验证方法的特异性。④灵敏度实验：取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液,以10倍比进行稀释至10-1～10-9,取各稀释度菌液1mL进行平板计数。同时,取各稀释度菌液1mL,用煮沸法提取DNA,取2μL上清液作为模板进行LAMP扩增。⑤原料乳样品的检测：采用建立的LAMP方法对从农场采的原料乳进行实际检测,同时采用金黄色葡萄球菌国标GB/T4789110-2003对样品进行检测,两种方法进行对比,确定LAMP直接检测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度。结果与分析1.LAMP方法反应条件的优化⑴反应温度BstDNA聚合酶的最适反映温度为65℃,选择57、59、61、63、65℃五个不同的反应温度,结果如图1,在同样的反应体系条件下,61℃时扩增的效果更好,因此最适LAMP反应温度为61℃。图1反应温度对LAMP反应的影响M:DL2000DNAMarker;1:57℃;2:59℃;3:61℃;4:63℃;5:65℃。图2Mg2+浓度对LAMP反应的影响M:DL2000DNAMarker;1:1mmol/L;2:2mmol/L;3:3mmol/L;4:4mmol/L;5:5mmol/L。⑵Mg2+浓度的影响选择以不同浓度的Mg2+梯度来优化LAMP反应体系中的Mg2+浓度,结果如图2,同等条件下为6mmol/L时,扩增最为明显,因此本实验LAMP反应体系的Mg2+浓度为6mmol/L。图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果2.特异性本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等其他菌株进行LAMP扩增反应,结果如图5所示,金黄色葡萄球菌有条带出现,其他菌株未出现条带,表明LAMP扩增反应特异性强。图3与图4金黄色葡萄球菌LAMP与PCR检测的灵敏性实验与PCR检测的灵敏性实验1:10-1;2:10-2;3:10-3;4:10-4;5:10-5;6:10-6;7:10-7;8:10-8;9:10-9。3.LAMP灵敏度实验及PCR检测当菌液稀释10ˉ8时,LAMP扩增产物,而当稀释10ˉ4到PCR已无扩增条带,说明LAMP扩增灵敏度高于PCR扩增。由平板计数计算表明,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu/mL时仍能检出。4.对样品的检测结果采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检测出阳性样品81份,GB/T4789.10-2003检测出阳性样品84份,LAMP阳性检出率为96.43%。图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果M:DL2000DNAMarker;1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌CGMCC111552;3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ-004;5:ETEC:44247(6∶15∶16);6:EPEC:44706(111∶58∶-);7:荧光假单胞菌CGMCC111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819;9:铜绿假单胞菌ATCC27853;10:志贺菌HJ-14;11:单增李斯特菌CMCC54002;12:单增李斯特菌HJ-35;13:大肠杆菌ATCC25922;14:大肠杆菌O157:H7;15:蜡样芽孢杆菌KLDS71;16:瑞士乳酸杆菌KLDS-8;17:乳酸乳球菌KLDS-36;18:嗜热链球菌KLDS;19:双岐乳杆菌KLDS;N:阴性对照。结论金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一,给奶业生产带来严重的影响。LAMP技术根据靶序列上的6个特定区域设计引物,在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下,恒温进行扩增,环引物的设计大大提高了反应的速度。由于反应过程中,核算合成时,从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结核,产生大量的焦磷酸酶使反应呈现混浊,可通过肉眼观察反应是否进行。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计合成了LAMP引物进行扩增,并对各反应条件进行优化,对大肠杆菌等实验结果显示特异性强。本研究对金黄色葡萄球菌的检测限8～9cfu/mL,比PCR的检测灵敏度高。另外,由于本文采用煮沸法提取模板DNA,使PCR灵敏度有些降低。总之,LAMP方法是一种特异性强、灵敏度高、方便快捷的检测方法,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的方法,具有很高的使用价值。谢谢欣赏！