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小组成员：王智硕、辛忞、于广乐2014.11.26增强型绿色编码荧光蛋白的基因序列：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA目的基因内限制性酶切位点如下：154Eco57I198Eco57I397Eco57I710Bsp1407I181BsiI1.背景介绍（introduction）绿色荧光蛋白的发现GFP的演化通过生物化学的方法将基因做小小的改变,就可以改变GFP中的氨基酸,得到变异GFP。如将65位的Ser变成The的GFP(S65T),吸收光谱发生红移,用蓝光激发后发光强度比原来的增加6倍。另一个突变型GFP(Y66HY145F),发光蓝移,在紫外光激发下发蓝光。这样就可以利用发光不同的GFP对同一个细胞内的不同蛋白进行标记。变异蛋白的吸收光谱可以从395nm移至480～501nm,发射光谱基本不变,而发光强度增加100倍。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力。综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP。GFP各种突变体GFP工作原理•GFP形状呈圆柱形，如一个桶，负责发光的基团位于桶中央，因此，GFP可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。GFP应用(1)研究基因表达的调控元件和蛋白定位;(2)研究基因表达的时序控制与空间定位;(3)发育分子机理研究,GFP可以作为活体标记,在原位观察细胞的生长和运动。特别对于身体透明的动物观察起来更方便;(4)筛选药物,由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白来观察单细胞内相互作用的靶蛋白,再分离出目的细胞,从而可用于大规模药物筛选;(5)临床检验,生产出GFP标记的抗原或抗体,就可以免疫诊断;(6)转基因动物和植物的筛选标记（可替代抗生素或抗除草剂）微生物在体内的感染途径,病毒和宿主的相互作用等,如将其插入动物、细菌或细胞的遗传信息中,随着细胞复制,可观察不断长大的癌症肿瘤、细菌的生长；(7)新加坡国立大学的科学家创造出的荧光斑马鱼,在紫外线照射下,能够发出绿光或红光。如果给基因加上一个“开关”,在遇到重金属、毒素、激素时,“打开”发光蛋白的基因,让斑马鱼立即发出特殊的荧光,就可以用于检测污染的水域。序列来源：pEGFP-N3质粒EGFP基因所用质粒介绍：克隆质粒：pUC19质粒该质粒可用于克隆目的基因，将目的基因插入到pUC19质粒的多克隆位点处，然后将质粒导入大肠杆菌DH5α中进行扩增，最终获得大量的目的基因；也可用于目的基因的保存。克隆载体因为在多克隆位点前没有启动子和表达元件，所以不能表达目的基因，只能复制基因。表达质粒：pET28a质粒该质粒可用于目的基因的表达，因为该质粒在多克隆位点的前面含有T7启动子及一些表达元件，可以启动插入的基因表达，最终获得目的蛋白。大肠杆菌表达载体：pET-28a质粒图为pET28a质粒的图谱pET-28a多克隆位点大肠杆菌表达系统---E.coliBL21（DE3）BL21（DE3）带有T7RNA聚合酶基因的λDE3溶原菌,T7RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE根据蛋白质亚基分子量的不同可以分开蛋白质。在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。蛋白分离方法：亲和纯化首先将亲和配基固定在柱上，然后将蛋白混合液过柱子，是亲和标签与配基结合进而将要纯化的蛋白固定在柱子上。再用可以使目的蛋白与配基解离的溶液洗脱目的蛋白。最终获得纯蛋白。亲和标签2.实验流程目的基因的获取（PCR方法扩增目的基因）重组质粒的构建重组质粒的转化转化子的筛选与验证目的蛋白的检测目的蛋白的分离纯化目的基因的诱导表达所用试剂：限制性内切酶：NdeⅠ、XhoⅠ内肽酶：ThrombinT4连接酶、TapDNA聚合酶相应的内切酶、连接酶和聚合酶反应buffer、dNTPs、双蒸水、CaCl2溶液、IPTG诱导物、卡那霉素等。PCR引物：扩增目的基因时的上下游引物和检测目的基因是否导入质粒时PCR的上下游引物。所用器材：恒温水浴锅、EP管、微量移液器、PCR仪、His-Tag亲和纯化柱等。所用培养基：LB培养基、麦康凯培养基时间安排：第一天：PCR获得目的基因，验证；第二天：目的基因、pET-28a质粒双酶切，连接；E.coliBL21(DE)感受态细胞的制备；第三天：重组质粒的转化；第四、五天：重组子的筛选与验证：酶切验证和PCR验证；第六天：目的基因诱导表达；第七天：目的蛋白的检测；第八天：目的蛋白的纯化。1.目的基因的获取设计引物从pEGFP-N3质粒中获取EGFP基因。设计引物如下：正向引物：(Tm=59.2℃)GGAATTCCATATGATGGTGAGCAAGGGCG保护碱基酶切位点（NdeⅠ）目的基因特有序列（16bp）逆向引物：(Tm=58.0℃)CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG保护碱基酶切位点（XhoⅠ）目的基因特有序列（22bp）3.实验过程PCR扩增目的基因：PCR反应体系：10XPCR缓冲液2.5μLdNTPs混合物2μL正向引物1μL逆向引物1μLpEGFP-N3质粒DNA1μLTapDNA聚合酶0.2μLddH2O12.3μL总体系20μLPCR反应程序：预变性：94℃5min变性：94℃45s退火：54℃45s29次循环延伸：72℃120s终延伸：72℃10min保存：4℃无限制PCR扩增完后可进行琼脂糖凝胶电泳检测}2.重组质粒的构建对目的基因和pET28a质粒进行酶切pET28aDNA或目的基因3μL10Xbuffer2μLNdeⅠ0.4μLXhoⅠ0.4μLddH2O14.2μL总体系20μL重组质粒的构建37℃恒温水浴锅中反应2h，然后取1μL样品进行电泳检测，看是否酶切完全。酶切后的样品可在-20℃下长期保存。digestedpET28aDNA2μLdigested目的基因5μLT4DNA连接酶1μL10Xbuffer2μLddH2O10μL总体系20μL16℃恒温水浴反应过夜，反应后样品可直接用于转化，或者至于-20℃长期保存。3.制备E.coliBL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法（一）受体菌培养1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落，接种于5mlLB培养基中，37C振荡培养过夜。2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5mlLB培养基中，37C振荡培养2-3h，至菌浓度OD600=0.3-0.5（二）感受态制备1.将培养液冰浴20min，取1.5ml菌液于无菌EP管中，4℃离心6000rpm，5min.2.重复上述操作，收集4.5ml菌液的菌体.3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体，冰上放置10min，4℃离心6000rpm，5min.4.弃上清，加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟后即为感受态细胞悬液。48h内置于冰上可以直接转化。若储存-70℃可以加入15%甘油保存一周。4.转化（1）5μL连接液100μL感受态细胞（2）0.5μLpET28a质粒100μL感受态细胞（3）5μLddH2O100μL感受态细胞混合均匀，冰浴10min42℃热击90s各加入1mL新鲜LB培养基，37℃复苏培养1h涂平板20μL50μL100μL200μL连接液麦康凯培养基+100μg/mLKanapET-28a质粒麦康凯培养基+100μg/mLKanaE.coliBL21(DE)麦康凯培养基+100μg/mLKanaE.coliBL21(DE)麦康凯培养基涂布完成后静置10~15min，于37℃恒温培养20~24h，观察菌落生长情况。5.结果观察与复筛验证红色菌落（1）平板菌落观察白色菌落红色菌落周围的白色菌落（2）挑取白色菌落在含有卡那霉素的麦康凯培养基上划线，37℃恒温培养12h。再从平板上挑取白色菌落接入含有卡那霉素的LB培养基中，37℃恒温培养12h。然后提取pET-28a质粒。（3）酶切验证5μL重组质粒DNA0.5μLNdeⅠ0.5μLXhoⅠ1μL10Xbuffer3μLddH2O———————————————10μL37℃，1h{酶切后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，检测重组质粒上是否连接上了目的基因。（4）进行PCR检测可以根据目的基因插入到载体的两侧序列设计进行PCR反应，检测是否能扩到目的基因。引物设计如下：正向引物：GCGCGGCAGCCATATGTm=63.6℃逆向引物：GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTm=65.2℃10XPCR缓冲液2.5μLdNTPs混合物2μL正向引物1μL逆向引物1μL重组质粒DNA1μLTapDNA聚合酶0.2μLddH2O12.3μL总体系20μLPCR反应体系：PCR反应程序：预变性：94℃5min变性：94℃45s退火：59℃45s29次循环延伸：72℃120s终延伸：72℃10min保存：4℃无限制PCR扩增完后可进行琼脂糖凝胶电泳检测看是否有目的基因。}6.目的基因的诱导表达——IPTG诱导表达1.取含有重组质粒pET-28a的BL21(DE)菌株的单菌落，接种于20mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。同时取只含质粒载体pET-28a的BL21(DE)菌株的单菌落做实验对照。2.分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基（实验组转接两瓶），37℃恒温培养1~2h。当细菌浓度A600达到0.4~0.6时，分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的样品，其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L，其中一瓶实验组不加IPTG的对照。继续培养，分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品，作为诱导后的样品。3.每次取1mL样品置于Eppendorf管中，冰浴待用。诱导