47液相色谱―质谱联用的原理及应用

液相色谱—质谱联用仪的使用农业分析测试中心杨黎芳1024主要内容仪器结构原理简介实验演示仪器结构WatersTQD液相色谱/三重串联四级杆质谱仪ArN2质谱仪器：质谱仪由以下几部分组成数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓进样系统离子源质量分析器检测接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛真空系统进样系统把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，LC及接口，加热进样，参考物进样等。离子源使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器。ESI电喷雾电离源真空系统质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。质量分析器:是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分，离子通过分析器后，按不同质荷比(M/Z)分开，将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。实验室现有的质量分析器类型：串联四极质谱仪(MS/MS)：三重四极（QqQ）离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器MS1MS2Q1q2Q3检测接收器：接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板数据及供电系统将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。从几伏低压到几千伏高压。现有备用电源原理简介质谱原理质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。常见术语:质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z。峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。离子丰度(Abundanceofions):检测器检测到的离子信号强度。离子相对丰度(Relativeabundanceofions):以质谱图中指定质荷比范围内最强峰(基峰)的强度为100％,其它离子峰对其归一化所得的强度。标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标。谱峰的离子丰度与物质的含量相关，因此是质谱定量的基础。总离子流图：在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图，也称TIC图。质量色谱图：指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图。液质联用(LC-MS)应用不挥发性化合物；极性化合物；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。具体应用领域生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。2.正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。3.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10-5mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。4.流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，。为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱，这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。5.辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。实验演示开机前的准备工作UPLC对流动相的要求有机溶剂要求用色谱纯(进口名牌最好)水或缓冲盐流动相要用超纯水(18.2MΩ),当天制备UPLC对洗针液的要求强洗针液用甲醇/水或乙腈/水(有机相的比例高于梯度洗脱的强溶剂的比例)弱洗针液用纯水或含少量甲醇或乙腈的水溶液(有机相的比例低于梯度洗脱的起始比例)清洗柱塞密封垫(SealWash)的溶液超纯水含5%-10%甲醇特别提示:以上溶剂或溶液均需:用0.22μm的膜过滤并脱气用洁净的玻璃容器盛放,避免污染仪器操作-开机样品管理器四元溶剂管理器质谱仪计算机电源待各仪器设备通过自检后(绿灯长亮),打开MassLynx软件设定0.1ml/min流速平衡色谱柱及系统(有液体流出)打开FLD(PDA)检测器电源（先不要开FLD或PDA电源——光学检测器的电源需待流动池内充满液体后再打开）MassLynx结构–主要的窗口应用软件程序选择仪器菜单工具菜单MassLynx主页面Shutdown/Start-up方法编辑MS方法编辑Tunepage调谐页面HPLC方法编辑Shutdown/start-up启用MSConsole/Intellistart主页面仪器菜单编辑一个液相方法（InletFile）选择一个MS文件打开项目电离电压PositiveESNegativeES2.503.752.003.00锥孔电压ConeVoltage10100萃取锥孔和RF透镜电压15ExtractorVoltage05RFLensVoltage离子源温度Infusion(5-40l/min)Sourcetemp.80Desolvationtemp.120HPLC(100-300l/min)Sourcetemp.Desolvationtemp.120300气流锥孔气去溶剂气3001000~100仪器调谐页面上的峰显示编写一个样品表（SampleList）采集数据打开一张色谱图数据类型以及离子模式Scan,MRM,SIR,PAR,NTLAPCI,ESI,(+/-)FileText文件名时间(minutes)保留时间100%刻度的强度色谱类型相对强度5pg/mlstd1.002.003.004.00Time0100%ASSAY07MRMof3ChannelsAP+TIC2.09e42.81InformationLayout质谱图可以从Masslynx窗口的samplelist的菜单中选择质谱图（spectrum）打开质谱图窗口。