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检测方法确认和验证•4.5.14检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制程序。检验检测方法包括标准方法、非标准方法（含自制方法）。应优先使用标准方法，并确保使用标准的有效版本。在使用标准方法前，应进行证实。在使用非标准方法（含自制方法）前，应进行确认。检验检测机构应跟踪方法的变化，并重新进行证实或确认。必要时检验检测机构应制定作业指导书。如确需方法偏离，应有文件规定，经技术判断和批准，并征得客户同意。当客户建议的方法不适合或已过期时，应通知客户。•非标准方法（含自制方法）的使用，应事先征得客户同意，并告知客户相关方法可能存在的风险。需要时，检验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程序，自制方法应经确认。•1、检验检测机构应建立和保持检验检测方法控制程序。检验检测机构应使用适合的方法（包括抽样方法）进行检验检测，该方法应满足客户需求，也应是检验检测机构获得资质认定许可的方法。查：是否建立和保持使用适合的检验检测方法和方法确认的程序；•2、检验检测方法包括标准方法和非标准方法，非标准方法包含自制方法。•3、当客户指定的方法是企业的方法时，则不能直接作为资质认定许可的方法，只有经过检验检测机构转换为其自身的方法并经确认后，方可申请检验检测机构资质认定。•4、检验检测机构在初次使用标准方法前，应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新予以证实，并提供相关证明材料。查：（1）检验检测报告是否使用检验检测标准的有效版本。（2）方法使用前是否进行验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。•5、检验检测机构在使用非标准方法前应进行确认，以确保该方法适用于预期的用途，并提供相关证明材料。查：非标准方法（含自制方法）使用前是否经确认，方法变更后是否重新进行确认，保留确认和验证记录。如果方法发生了变化，应重新予以确认，并提供相关证明材料。查方法变更后是否进行验证，保留方法验证记录，以证实检验检测机构能有效使用这些方法。•6、如果标准、规范、方法不能被操作人员直接使用，或其内容不便于理解，规定不够简明或缺少足够的信息，或方法中有可选择的步骤，会在方法运用时造成因人而异，可能影响检验检测数据和结果正确性时，则应制定作业指导书（含附加细则或补充文件）。•查：是否制定必要的作业指导书，查证作业指导书目录，审核其内容是否满足要求。•查：核查检验检测细则（或作业指导书）是否满足要求。（必要时，细化标准要求）•7、偏离指一定的允许范围、一定的数量和一定的时间段等条件下的书面许可。检验检测机构应建立允许偏离方法的文件规定。不应将非标准方法作为方法偏离处理。查：方法偏离是否同时满足：有方法偏离文件规定和经技术判定不影响结果、经批准和客户同意四个条件，实施方法偏离时，是否保留记录。•8、当客户建议的方法不适合或已过期时，应通知客户。如果客户坚持使用不适合或已过期的方法时，检验检测机构应在委托合同和结果报告中予以说明，应在结果报告中明确该方法获得资质认定的情况。查查：客户建议的检验检测方法不适当时，机构是否通知客户，是否有必要的记录。•9、检验检测机构应制定程序规范自己制定的检验检测方法的设计开发、资源配置、人员、职责和权限、输入与输出等过程，自己制定的方法必须经确认后使用。•查：非标准方法的使用，是否与客户达成协议。协议中是否包括能否满足客户要求的说明。•查：非标准方法（含自制方法）的使用，事先征得客户同意，并告知客户相关方法可能存在的风险等情况记录。•在方法制定过程中，需进行定期评审，以验证客户的需求能得到满足。使用自制方法完成客户任务时，需事前征得客户同意，并告知客户可能存在的风险。查：检验检测机构应建立和保持开发自制方法控制程序（无参照方法情况），•查：是否有自定方法，是否是有计划及指定有资格经验的人员进行该项工作（查人员要求）。•查：是否进行方法的可靠性确认和验证、规定方法的评价和使用等。是否实施受控管理并保存记录。比较证实确认偏离对象标准方法非标方法标准、非标目的是否有能力按照标准方法展开检测校准工作是否使用临时使用、非常态方法从“人机料法环测”去证明用五种方法来确认或组合技术判定（一定误差范围内、一定的数量、一定的时间段）时限使用一段时间在转化为标准方法前偏离后仍需回归常态•确认应是以下五种中的一种或组合，是成本、风险和技术可行性的一种平衡（不确定度、检出限、方法的选择性、线性、重复性、稳健度、基体干扰等）•1、使用参考标准或参考物质；2与其他方法比较；3、实验室间比对；4、对影响结果因素系统评价；5、不确定度的评定•保留确认和验证记录检测方法的研究验证•参照《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB/T27404-2008）对选择的检测方法应分别对方法选择性、回收率、标准（校准）曲线、精密度等技术要素进行确认，必要时测定低限、准确度、稳定性、适用性（耐用性）提取效率、不确定度（SD）等要素进行确认。选择性•对所选的方法，根据配方中各成分可能存在的干扰分别进行试验。在功效成分(如总黄酮)来源于配方多种物质，应研究各物质对其指标的贡献。选择性是衡量某一方法在实用中受其他因素影响程度大小的一种量度。较高的选择性，是获得较高准确度的条件之。•用某种分析方法测定某组分时，能够避免样品中其他共存组分干扰的能力。选择性的表示通常在指定的测量准确度下，共存组分的允许量与待测组分含量的比值。•n=W（共存组分）/W（待测组分），比值越大，表明在指定的准确度下，该仪器方法的抗干扰能力越强，即选择性越好。提高分析方法的选择性是分析化学中的一个研究内容。•可以通过不同的途径加以改善或提高。常取途径有二：①从仪器上改进，例如，采用高效液相色谱法可以大大提高色谱分析的选择性。在紫外-可见分光光度法中采用多阶导数处理，不仅可以使灵敏度得到提高，更重要的是使方法选择性得到改善。②改进分析对应的条件，合理选择反应的酸度、介质、反应离子的价态以及使用隐蔽剂等。回收率•回收率是在没有标准物质情况下，测定的平均值与真值相符的程度。应在标准值点、标准值点的上下20%，或标准曲线内的高中低进行三水平试验，或在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验;对于已制定最高残留限量(MRL)的，回收率应在方法测定低限、MRL、选一合适点进行三水平试验;对于未制定MRL的，回收率应在方法测定低限、常见限量指标、选一合适点进行三水平试验。•用回收率表示方法，加入的标准物质的回收率按式（1）进行计算。•P=（x1-x2）/m（1）•式中：P——加入的标准物质的回收率；m——加入的标准物质的量；X1——加标试样的测定值；X2——未加标试样测定值。回收率的参考范围见表2。•表2回收率范围•被测组分含量/(mg/kg)回收率范围/%•10095-105•1-10090-110•0.1-180-110•0.160一120•标准（工作）曲线•应描述校准曲线的数学方程以及校准曲线的工作范围，浓度范围尽可能覆盖一个数量级，至少作5个点(不包括空白)。相关系数（r）不应低于0.99，测试溶液中被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内。•回归方程的计算在绘制标准曲线时，可用直线回归方程式计算，然后根据计算结果绘制。用最小二乘法计算直线回归方程的公式y=a+bX。精密度•同一样品的各测定值的符合程度为精密度。精密度试验值应在标准值点或±20%，或标准曲线内的高中低三水平试验值内。对于已制定MRL的，精密度实验应在方法测定低限、MRL、选一适合点三个水平进行；对于未制定MRL的，精密度实验应在方法测定低限、常见限量指标中选一适合点三个水平进行。重复测定次数至少为6。实验室内部的变异系数参考范围见表3。•在某一实验室，使用同一操作方法，测定同一稳定样品时，允许变化的因素有操作者、时间、试剂、仪器等，测定值之间的相对偏差即为该方法在实验室内的精度。•表3实验室内变异系数(CV)/%•被测组分含量CV%被测组分含量CV%•0.1μg/kg43100mg/kg5.3•1μg/kg301000mg/kg3.8•10μg/kg211%2.7•100μg/kg1510%2.0•1mg/kg11100%1.3•10mg/kg7.5•检测限、定量下限测定低限（主成分测定可不需要）•把3倍空白值的标准偏差（测定次数n≥20）相对应的质量或浓度称为检出限。方法的测定低限按式（2）计算:CL=3Sb/b（2）•式中:CL—方法的测定低限;•Sb—空白值标准偏差(一般平行测定20次得到);•b—方法校准曲线的斜率。•色谱法（GC、HPLC）•设：色谱仪最低响应值为S=3N（N为仪器噪音水平），则检出限按式（3）进行计算。检出限=最低响应值/b=S/b（3）•式中：•b——标准曲线回归方程中的斜率，响应值/μg或响应值/ng；S——为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。•7.5.2吸光法和荧光法•按国际理论与应用化学家联合（IUPAC）规定。•全试剂空白响应值按式（4）进行计算。XL=平均值+Ks（4）•式中：•XL——全试剂空白响应值（除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量（滴定法中标准滴定液的用量除外），进行平行操作所得的结果。•平均值——测定n次空白溶液的平均值（n≥20）；•s——n次空白值的标准偏差；•K——根据一定置信度确定的系数。•对于已制定MRL的物质，方法测定低限加上样品在MRL处的标准偏差的三倍，不应超过MRL值。对于禁用物质，方法测定低限应尽可能低。准确度•重复分析标准物质(实物标样)或水平测试样品，测定含量(经回收率校正后)平均值与真值的偏差指导范围见表3。•表3测定值与真值的偏差指导范围•真值含量/(mg/kg)偏差范围/%•0.001-50~+20•0.001~0.01-30~+10•0.010~10-20~+10•l0~100015•1000~1000010•100005稳定性•在测定的浓度下，设置不同的时间段进行测定，经过实验证明样品稳定的时间。耐用性•方法应具有对可变试验因素的抗干扰能力，当测定条件发生细小变动时，方法应具有一定的保持测定结果不受影响的承受程度。并给出平行两次测定的允差。•例如，分析中的样品性质、•pH值、温度、所用试剂品种及使用量、人员等分析条件在适当的范围内改变时，对测定值的稳定性进行的研究结果。其中，试样性质是需要重点考虑的内容之一，任何一种方法都有其试样适应范围，能否针对某种试样采用该分析方法需要经过严格的验证，技术参数符合要求时方可采用，并形成相应的报告。•不同的色谱柱、试剂批号和牌号之间存在着一定的差别，这些差别可能直接会影响到结果的准确与否，因此当改变上述内容时均需要进行验证性实验并形成相应的报告。对于色谱柱还应确定拖尾因子、分离度、容量因子、塔板数等指标。提取效率•提取效率可用以下方法进行试验:•a)用阳性的标准物质或水平测试的阳性样品进行试验;•b)阳性样品用同一溶剂反复提取，观察被分析物的浓度变化;•c)用不同提取技术或不同提取溶剂进行比较。不确定度•测量不确定度是指“表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数”