分子生物学实验室工作手册第十二章

分子生物学实验室工作手册分子生物学实验室工作手册第十二章：DNA、RNA、蛋白质蛋白质DNARNADNADNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。DNA介绍DNA是相当稳定的，这是保存和传递遗传信息的所必备的条件。但是对待DNA也不能大意，常常会DNA的污染。污染主要来源于其它的DNA。DNA的分离概述：1.DNA的分离现已多用试剂盒提取，有小量，中量，大量提取三种。实验室一般销小量提取多见。2.试剂盒可分离基因组，染色体组以外的DNA。如：琼脂糖凝胶中分离DNA、PCR产物中分离DNA。3.一般分离试剂盒是使用结合DNA的树脂或者滤膜，避免了酚抽提和CsCl超离心。4.染色体外的DNA作为噬菌体或者质粒DNA被抽提出来。5.大片段的DNA(30Kb)，必须小心操作，防止断裂。如：基因组。6.不同实验对DNA的要求不一致，因此分离之后的鉴定也很重要，鉴定方法各不相同。例：酶切、测序等。一.DNA的分离1.碱-SDS质粒小量制备（1）培养物1.5ml，置于离心管内。（2）10000g离心2min，弃上清。（3）100ul预冷的solutionⅠ重悬，振荡2min。（4）常温放置5min。（充分裂解释放DNA）（5）200ulsolutionⅡ，上下颠倒5s。（不要太剧烈，振荡会损伤DNA）（6）水浴5min，12000g离心5min。（7）加200ul冰上预冷的solutionⅢ，上下颠倒20s，混匀。（8）水浴5min，12000g离心5min，将上清移至新的EP管内。（9）加入5ul2mg/mlRNaseA,37度放5min。（10）加入（≤450ml）的酚-氯仿抽提。（见后）（11）乙醇浓缩。(见后)（12）70%乙醇沉淀，离心1min，吸去上清，挥发干酒精。（13）25ulTE重悬沉淀，2-4ul电泳。（14）-20℃保存。2.DNA酚抽提目的：去除DNA中的蛋白质原理：酚和水互不相容，形成两相，DNA溶于水相，蛋白质溶于酚相。方法：DNA样品+等体积的酚氯仿→剧烈振荡20s→常温离心5min→小心转移上层水相于新的EP管→加入等体积酚氯仿重复抽提。3.DNA乙醇浓缩沉淀目的：浓缩DNA，阻止许多没反应的残余氯仿。方法：DNA样品（450ul）+十分之一体积的pH4.2、3mol/l的NaAc快速颠倒混匀→加入2倍体积的95%的无水乙醇，充分混匀→冷环境中沉淀（-20℃过夜或者-70℃30min或者干冰5min）→高速（≥12000g）离心15-30min→去上清，挥发酒精→预冷70%的乙醇洗涤，挥发玩酒精→加pH8.0TE重悬DNA。4.使用真空浓缩机(干燥浓缩的DNA)5.紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度文本文本文本文本文本文本文本文本寡核苷酸（20bp）文本文本文本文本文本文本文本文本二.DNA的扩增---PCR•聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。生物体外的特殊DNA复制。•原理：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。PCR反应体系：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μlMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100μlPCR的注意事项•1.远离PCR仪及其他污染源制备PCR样品。•2.PCR的移液器与其他移液器分开使用，防止交叉污染。•3.实验过程中戴手套和口罩，尽量不要说话。•4.反应体系中最后才加DNA。三.将DNA导入细胞和微生物原核细胞•1.一般转化法：①扩增克隆的DNA（不表达载体的细菌）②获得大量DNA编码的蛋白质（表达载体的细菌）•2.与高浓度的钙离子温育：操作简单，耗时短，只需几分钟即可完成。•3.电转化：最佳条件取决于细菌物种•注意：载体和所选的细胞类型是转化成功与否的关键，实验之前要选好。真核细胞真核细胞的转化称为转染：转化+感染感染:病毒介导的基因传递报告基因：转染的携带DNA的细胞会表达一些报告基因而被选择出来。如：能抵抗某种抗生素，GEP(绿色荧光蛋白)等。转染的方法：1.磷酸钙共沉淀法2.DEAE右旋糖酐介导的转染3.脂质体介导的转染4.电转化5.微注射6.病毒介导的转导例：SV40、腺病毒、逆转录病毒等质粒•质粒（Plasmid）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA）,也称为cccDNA,其大小通常在1~100KB范围内。质粒的分类•质粒分为两类：1.严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；2.松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。质粒•质粒的形式：①超螺旋DNA：在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。②开环DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA。③线状DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。质粒的提取•从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：•1.培养细菌使质粒扩增；•2.收集和裂解细胞；•3.分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁。十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。碱-SDS质粒小量制备（1）培养物1.5ml，置于离心管内。（2）10000g离心2min，弃上清。（3）100ul预冷的solutionⅠ重悬，振荡2min。（4）常温放置5min。（充分裂解释放DNA）（5）200ulsolutionⅡ，上下颠倒5s。（不要太剧烈，振荡会损伤DNA）（6）水浴5min，12000g离心5min。（7）加200ul冰上预冷的solutionⅢ，上下颠倒20s，混匀。（8）水浴5min，12000g离心5min，将上清移至新的EP管内。（9）加入5ul2mg/mlRNaseA,37度放5min。（10）加入（≤450ml）的酚-氯仿抽提。（见后）（11）乙醇浓缩。(见后)（12）70%乙醇沉淀，离心1min，吸去上清，挥发干酒精。（13）25ulTE重悬沉淀，2-4ul电泳。（14）-20℃保存。Thanks