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《分子生物学》教案一、课程性质必修课二、教学目的要求分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。从学科角度来讲，分子生物学函盖面非常广，与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交叉。在学习本课程之前，要求学生已掌握了必要的数、理、化知识，并学习了植物学、动物学、微生物学与生物化学等基础课程。通过对本课程的学习，使学生掌握基因概念在分子水平上的发展与演变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达（在转录、翻译水平）的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理，了解新兴起的基因组学和后基因组学研究现状。通过与实验课相结合，系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术，使学生们掌握一些基本的分子生物学技术。三、教材及有关参考书朱玉贤等，《现代分子生物学》高等教育出版社，2002BenjaminLewin编著余龙等主译，《GeneⅧ》科学出版社，2005赵寿元等，《现代遗传学》高等教育出版社，2001孙乃恩等，《分子遗传学》南京大学出版社，1990四、适用专业生物科学、生物技术、生物工程、科学教育等专业五、授课学时36学时六、课程内容第一章绪论教学目的：使学生对分子生物学的发展简史、分子生物学的研究内容及发展前景有较全面的了解。教学重点、难点：基因概念的发展与演变；对现代遗传学各发展阶段的认识。课时安排：4学时教学内容：一、什么是分子生物学？分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。二、分子生物学的发展简史从1847年Schleiden和Schwann提出细胞学说，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将性状与基因相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。总结与分子生物学相关的诺贝尔奖。三、分子生物学的主要研究内容1．DNA重组技术------基因工程基因工程指将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。DNA重组技术有着广阔的应用前景：①在生物技术制药领域中的应用。如：利用基因工程技术改造传统的制药工业；利用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。②定向改造某些生物的基因组结构，使它们具备某些特殊的经济价值。③在基础研究中的应用。如：基因的克隆与分析；启动子分析。2．基因表达调控因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。3．生物大分子结构功能----结构分子生物学生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。4．功能基因组学与生物信息学研究先后完成了包括从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫等十余种模式生物基因组全序列的测定工作，并于2002年2月12日完成人类基因组测序工作。世界两大最著名的学术刊物－nature和science同时发表了人类基因组全序列。基因组测序工作的进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此读懂基因组称为后基因组时代的生命科学领域面临的巨大的挑战。在功能基因组时代，应用生物信息学方法，高通量地注释基因组所有编码产物的生物学功能是一个重要的特征。生物信息学是在各种“组学”研究的推动下发展起来的.传统的研究方法是只研究某一个基因或蛋白质或转录产物，而“组学“的研究是采用高通量的技术分析细胞中全部的基因和蛋白质，这样势必会产生海量的信息，因此，人们必须寻求一种高速度、高效率、大规模的方式积累数据处理分析方法。四、分子生物学展望未来的发展方向：不同模式生物基因调控网络的比较分析；RNA介导的基因表达调控网络；表观遗传（epigenetic）信息的整合；从数据整合到系统生物学（systemsbiology）。第二章遗传的物质基础－DNA教学目的：使学生了解并掌握DNA的结构与功能教学重点、难点：DNA的一级结构的测定，DNA的二级结构及超螺旋结构。课时安排：4学时教学内容：第一节DNA的一级结构一、一级结构的构成所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。二、一级结构的序列测定目前所用的DNA测序方法是在末端终止法的基础上发展起来的。由英国科学家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列测定方面做出了杰出贡献。他曾在1953年利用小片段重迭法成功测定了胰岛素51个氨基酸序列，并获得诺贝尔奖。1977年又利用末端终止法测定了X174噬菌体得DNA序列，第二次获得诺贝尔奖。末端终止法又称为双脱氧法，基本原理是模拟体内DNA的复制过程在体外合成DNA，通过测定DNA片段的相对长度来推断核苷酸序列。至于成分大家不要死记，可以回忆一下DNA复制过程需要哪几种组分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一种dNTP的磷酸基团用P32标记。除此之外还需要每个管中分别加入一种ddNTP。DDNTP是双脱氧核苷酸，由于在3位上缺少-OH，无法与下一个单体之间形成磷酸二酯键，因此，一旦掺入DNA链的延伸后，便终止DNA的合成这样，在DNA聚合酶的作用下核苷酸链不断延伸，我们可以调整dNTP和ddNTP的浓度，使ddNTP在每个位置上都有一个掺入的机会。每个管都会产生一系列长短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一个碱基是相同的。我们将所得的所有DNA片段进行凝胶电泳，长度不同，泳动的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可将相差一个碱基的DNA片段区分开，由于dCTP是放射性标记的，我们将凝胶放射自显影后，有DNA片段的位置就会显示出相应的信号带。自下而上依次将碱基序列读出。第二节DNA的二级结构一、二级结构的特点DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的；2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。二、变性、复性及杂交变性：指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，只涉及次级键的破坏。常用的DNA变性方法：热变性和用变性剂处理。如何判断DNA是否发生变性了呢？常用的方法是测定DNA的光吸收值。在碱基的嘌呤环和嘧啶环中存在共扼双键，在240－290nm波长有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白质由于存在肽键，在280nm有明显的吸收峰）当DNA变性时，有序的碱基排列被破坏，光吸收值显著增加，该现象称为增色效应。当缓慢增加DNA溶液的温度时，记录不同温度下的A260的数值，即绘制成DNA的变性曲线。以温度为横坐标，以A260为纵坐标。当A260增加到最大值的一半时，这时的温度称为DNA的溶解温度或熔点，Tm表示。除此之外，光吸收法也是实验室定量测定DNA和RNA浓度和纯度的一种方法。从某种样品中提取了基因组DNA，可根据A260/A280的比值判断其纯度。复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。杂交：在退火条件下，带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的互补区段会形成双链结构。分子杂交是分子生物学常用的技术，可用来检测某一特定基因的时空表达情况和在基因组中的。分子杂交最初是由Southern设计出来的。当时是用DNA探针检测的DNA，也就是DNA与DNA的杂交，人们就将这种方法称为是Southernblotting。在此基础上，人们设计出DNA探针检测RNA，称为Northernblotting。基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern、northern）是一致的，都是探针和互补的靶基因结合，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片（DNAmicroarray）指将N个目的DNA用自动化设备点在固体支持物上，DNA经固化后，用不同颜色的荧光标记的探针对这些DNA同时进行杂交，根据杂交结果呈现的不同颜色，经计算机分析后得到关于N个基因表达情况的数据。第三节DNA的高级结构一、超螺旋结构及拓扑异构体双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。二、拓扑异构变化的生物学意义DNA拓扑异