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预防医学1403班小组成员：01王璟02楚歆03宋娟04席玥讨论题4分子生物学第四次讨论讨论题目：已知目的基因的cDNA序列（GenBank登录号：AK135903.1），拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。根据133-1941的序列，设计PCR引物从cDNA中扩增该序列得到扩增产物后将产物插入质粒该质粒扩增后转染哺乳动物细胞，纯化后进行表达1234我们的方案：根据133-1941的序列，设计PCR引物引物设计目的、原理及原则1搜索、设计引物3学习使用GenBank2根据原则筛选引物4引物设计的目的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。引物设计的原理1、择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为40～60％。5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3’末端的互补。引物的设计原则（详见课本P.164）①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。1.从网站中对该基因进行搜索，输入登录号：AK135903.12.查询可知其序列为3.直接在genbank中得到的引物序列结果pair3、pair5的3'端有三个连续的碱基，舍去。pair1的3'端末尾有碱基A，舍去。pair6，pair7的3'端末尾是碱基A，舍去。所以，可用的引物序列为：pair2、pair4搜索引物点击getprimers后得到不同的引物方案从cDNA中扩增该序列（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl；（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心；（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。一、PCR主要原料模板DNATaqDNA聚合酶引物（提前设计并合成与目的DNA两侧互补的引物，琼脂糖凝胶电泳，分离和纯化PCR产物-）二、利用PCR技术扩增目的基因得到扩增产物后将产物插入质粒基因表达载体的构建表达载体构建流程获得人工质粒载体分子(pBR322)用限制性核酸内切酶（BamHI：GGATCC）切割目的基因DNA片段与运载体碱性磷酸酶处理载体（去掉线性DNA分子5‘端磷酸根，防止质粒自身环化，便于与目的基因片段连接）用DNA连接酶连接运载体和目的基因转染与纯化原理：质粒的转染外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。转染的步骤细胞传代(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。细胞转染1）转染试剂的准备A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。5）将混合液在室温放置10—15分钟。6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。第二次细胞传代1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。3）在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。PCR的纯化•原理PCR产物一般都含有过量的引物、TagDNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。3、再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。2、加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中.这样抽提一次，可除去覆盖在表面的矿物油。4、在水相中加300μl95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。.JPG（一）酚/氯仿法1、取反应产物加100μlTE.。5、在小离心机上10000rpm离心10min，吸净上清液。加入1ml70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7mlddH2O中，待用。.（一）酚/氯仿法（二）WizardPCRDNA纯化系统WizardPCRDNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50mlWizardPCRDNA纯化树脂5ml直接提取缓冲液50支Wizard微型柱3、加1mlPCRDNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。4、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。（二）WizardPCRDNA纯化系统1、吸取PCR反应液水相放于1.5mleppendorf管中。（二）WizardPCRDNA纯化系统5、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入2ml80%异丙醇，对微型柱进行清洗。6、取出微型柱置于eppendorf管中，12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μlTE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。（二）WizardPCRDNA纯化系统8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃注意1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的产量。THANKS感谢老师这四周的陪伴与耐心的讲解^^