第14章基因工程2

目录基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章目录主讲人：官秀梅[e-mail]目录基因重组：基因重组是不同来源的DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。目录基因工程：基因工程是指在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件中，形成重组的DNA分子，并在宿主细胞中增殖。利用这一技术可以扩增DNA，生产蛋白质，或者创造生物新品种。该技术又称为重组DNA技术、DNA克隆、分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。目录1972年Berg在基因工程基础研究方面作出了杰出贡献，作为“重组DNA技术之父”获1980年诺贝尔奖。PaulBerg（伯格）美国人HerbertBoyer（博耶）StanleyCohen（科恩）美国人1973年Cohen等用核酸限制性内切酶EcoR1，首次基因重组成功。目录目录第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequentlyinNature目录基因重组：不同来源的DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。重组类型：同源重组、特异位点重组、转座重组一、概念：目录（一）概念：发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。一、同源重组目录（二）同源重组特点：①不需要特异DNA序列，而是依赖两分子间序列的相同或相似性（同源性）；②并且同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方能交换；③重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失。目录（三）机制：可用1964年RobinHolliday提出的Holliday模型解释。目录Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)目录片段重组体（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´目录内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录目录Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录目录目录目录RecBCD蛋白具有三种酶活性：①依赖ATP的核酸外切酶；②ATP增强的核酸内切酶；③需要ATP的解旋酶活性。利用ATP水解提供能量，沿着DNA链运动，并以较快的速度将前方DNA解旋，当遇到CHI（因交换位点的DNA结构类似于希腊字母χ而得名）位点（5ˊGCTGGTGG3ˊ）时，可在其下游切出3ˊ末端的游离单链。从而使DNA重组成为可能。E.coli同源重组分子机制：需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、RecBCD复合物及RuvC蛋白。目录RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA，形成RecA—ssDNA复合物。RecA蛋白具有多个DNA结合位点，因此线性RecA—ssDNA复合物可以通过插入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子，从而完成DNA重组。目录RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择的切开DNA链可切开同源重组的中间体。目录E.Coli的同源重组过程:首先由RecB、RecC、RecD的复合物使DNA产生单链切口；RecA蛋白催化单链DNA对另一双链DNA的侵入，并与其中的一条链交叉，RuvA和RuvB使交叉分支移动，待相交的另一链在RecBCD内切酶催化下断裂后，由DNA连接酶连接缺失的远末端，形成Holliday中间体；此中间体再经内切酶RuvC切割、DNA连接酶连接完成重组。目录(四).功能1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。2.是DNA损伤修复的重要机制之一。目录二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用(conjugation)当细胞与细胞、或细胞与细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用(conjugation)。细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。目录质粒：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子目录并非所有质粒DNA都能转移，而是只有某些较大的质粒（如F因子）才能通过接合作用发生转移。因F因子含有细菌的性鞭毛蛋白编码基因。能表达形成细菌的表面性鞭毛。目录可接合质粒如F因子(Ffactor)F+F-性鞭毛连接酶切单链5’目录（二）转化作用(transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。目录例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。具有摄取周围环境游离DNA分子能力的细胞称为：感受态细胞有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。目录例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录（三）转导作用(transduction)当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生DNA转移和基因重组。过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。目录1.溶菌性生长途径：噬菌体DNA在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。目录2.溶源性生长途径：是噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主DNA复制而被动复制，这种整合了噬菌体DNA的细菌称为溶源菌。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌体DNA从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。目录目录当原噬菌体DNA从细菌染色体被切下时，如果有部分宿主DNA被随着切下，这种带有宿主菌DNA的噬菌体称为转导噬菌体。转导噬菌体再次感染细菌时就可将前一宿主DNA转移至新的宿主细胞，发生转导作用。如图目录溶菌性生长目录Cohesive-endsite目录（四）细胞融合人工的或自然发生的细胞合并形成多核细胞的现象。目录三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合种类：①λ噬菌体DNA的整合；②细菌的特异位点重组；③免疫球蛋白基因的重排；④转座重组等。概念：在整合酶催化下，在两个DNA序列的特异位点之间发生的整合作用称为位点特异重组(site-specificrecombination)目录在λ噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；（一）λ噬菌体DNA的整合（了解）目录2.特异位点：λ噬菌体重组的特异位点称attP(attachmentsitephage)，含P、O和P‘三个序列组成。大肠杆菌的重组位点attB（attachmentsitebacteria），含B、O和B`三个序列。O是15bp的核心序列，是attB和attP所共同的。而其两侧的序列是B，B’和P，P`,被称为臂。整合酶与两个核心序列都相结合。POP`BOB`目录（2）整合宿主因子（integrationhostfactorIHF）由大肠杆菌产生，结合于attP，对整合起促进作用。（3）切除酶（excisionaseXis）由λ噬菌体xis基因编码。指导λ噬菌体DNA从宿主的染色体中切出来。4.过程：λ噬菌体编码整合酶。这个酶能指导λ噬菌体DNA通过重组位点attP插入E.coli的重组位点attB处发生交叉重组，将两个较小的环状DNA分子变成一个大环。3.参与整合的酶（1）整合酶（integraseInt）：由λ噬菌体int基因编码，指导λ噬菌体DNA插入到宿主的染色体中。目录λ噬菌体POP’包装感染宿主POP’×BOB’IntIntXisIHFIHFBOP’POB’图23-21λ噬菌体的整合和切离目录反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。调节和启动转录LTRgagpolenvsrcLTR长末端重复序列癌基因正常的病毒基因产生病毒核心蛋白产生逆转录酶和整合酶产生病毒外膜蛋白产生酪氨酸激酶目录鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反H抗原，这种现象称为鞭毛相转变。这种抗原相位的改变是由一段995bp的DNA——H片段,发生倒位所致。（二）细菌的特异位点重组（了解）目录1.H片段的组成和功能：①两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重组位点-hix），二者方向相反。②中间是hin基因，编码特异的重组酶-倒位酶，催化H片段倒位重组。③hin基因两端各有一个启动子（P），其中一个启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的H2和rH1基因表达，分别产生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制远方H1基因的表达。目录2.倒位重组及后果：以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。因为没有了启动子，其结果是H2和rH1基因不表达。但远方的H1基因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不表达两种。目录辅助因子FisFis(factorforinversionstimulation)目录沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类基因片段。L-前导片段；V-可变片段；J-连接片段；C-恒定片段。重链的基因族上有L、V、D、J、C五类基因片段，D-多样性片段。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC目录重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequ