药物分析第11章抗生素类药物分析

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第十一章抗生素类药物的分析抗生素是指由微生物所产生、极微量即具有选择性地抑制或杀灭其他微生物的一类有机化合物。一、抗生素药物的特点抗生素在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。第一节概述1.生物合成(发酵)2.化学合成或半合成细菌放线菌真菌抗生素药物具有选择性地抑制或杀灭其他微生物作用的药物。控制抗生素质量的复杂性*分子结构多不稳定*发酵过程不易控制生产工艺复杂稳定性差发酵液中含有各种无机盐、脂肪、蛋白质、降解产物、色素、热原、毒性物质*发酵过程易受污染*易降解疗效↓失效毒副作用↑二、抗生素药物的质量分析(一)鉴别试验1.理化法2.生物学法(1)化学法(2)仪器法例青霉素钠Ch.P(2000)【鉴别】(1)取本品与已知含量的青霉素适量,分别加水制成每1ml中约含50mg的溶液,各取1ml,加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml,在37℃灭活1小时后,取灭菌滤纸片,分别用上述溶液浸湿后,用滤纸吸去多余的液体,置摊布金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培养基上。在37℃培养约16小时后均无抑菌作用,而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用.(二)检查一般杂质、特殊杂质常增加“安全性检查”【检查】异常毒性热原细菌内毒素降压物质无菌例盐酸四环素Ch.P(2005)【检查】酸度溶液的澄清度有关物质干燥失重杂质吸光度热原无菌(三)含量测定1.生物学方法以生物学方法或生化方法测定生理活性物质,并按效价单位(IU)计算的测定方法抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法以抗生素抑制微生物生长或杀死微生物的能力作为衡量效价的标准Ch.P→管碟琼脂扩散法比浊法USP例磺苄西林钠Ch.P(2005)【含量测定】精密称取本品适量,用灭菌水制成每1ml中约含1000单位的溶液,照抗生素微生物检定法(附录ⅪA)测定。1000磺苄西林单位相当于1mg的C16H18N2O7S2。例抗生素【含量测定】Ch.P(2005)抗生素微生物检定法(附录ⅪA)红霉素、两性霉素B、杆菌肽、硫酸多黏菌素B、硫酸庆大霉素、硫酸阿米卡星、硫酸卷曲霉素、硫酸核糖霉素、硫酸链霉素、磺苄西林钠原料及制剂微生物检定法优点*与临床效果一致*灵敏度高*干扰物质少*可用于未知药物缺点*操作繁琐*耗时*准确度、精密度差以理化方法测定主药含量,按有效物质的质量计算的测定方法优点*准确度高*简便快速缺点*不一定代表生物效价*易受杂质干扰*仅用于己知药物2.理化方法Ch.P(2005)【含量测定】青霉素类滴定法UVHPLC法微生物检定法头孢菌素类HPLC法汞量法碘量法细菌枯草菌真菌青霉素类、头孢类、灰黄霉素放线菌链霉素1.按产生菌分类三、抗生素的分类广谱青霉素、头孢类G+红霉素(金葡菌)G-卡那霉素、庆大霉素绿脓杆菌阿莫西林2.按抗菌谱分类3.按作用机制分类抑制转肽酶交联方式青霉素抑制蛋白质合成过程红霉素影响细胞膜通透性多粘菌素4.按化学结构和性质分类β-内酰胺类多烯大环类氨基糖苷类多肽类四环素类苯烃胺类大环内酯类蒽环类等第二节-内酰胺类抗生素青霉素类青霉素钠(钾)氨苄西林(钠)阿莫西林(钠)普鲁卡因青霉素头孢菌素类头孢氨苄头孢羟氨苄头孢拉啶头孢噻吩钠RCONSCH3CH3COOHOHN青霉素类RCONONHSCH2R1COOH头孢菌素类一、结构与性质(一)结构氢化噻唑环氢化噻嗪环-内酰胺环RCONSCH3CH3COOHOHNRCONONHSCH2R1COOH青霉素类头孢菌素类123456712346578RCONSCH3CH3COOHOHN青霉素类母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)-内酰胺环酰胺侧链酸性手性CCH2COHNNSOCH3CH3COOH青霉素G(苄青霉素)HONNOSHHCH3CH3HOOH青霉素钾KNa青霉素钠ONNOSHHCH3CH3HOOKH青霉素钾(lidocainehydrochloride)ONNOSHHCH3CH3HOONaH青霉素钠(Benzylpenicillinsodium)COHNNSOCH3CH3COOHCHNH2氨苄西林(氨苄青霉素)(ampicillin)ONNOSHHCH3CH3HNH2HONaOHCOHNNSOCH3CH3COOHCHNH2HO阿莫西林(羟氨苄青霉素)(amoxicillin)NHONH2NHOSHCH3CH3HOOOHHH,3H2OCH2COHNNSOCH3CH3COOHNH2(C2H5)2NCH2CH2OOC·普鲁卡因青霉素(procainebenzylpenicillin)ONCH3H3CH2NOONSNOHHHCH3CH3OHOH·COHNNSOCH3CH3COONaCHSO3Na磺苄西林钠(sulbenicillinsodium)HONNOSHHCH3CH3HONaOOOONaS头孢菌素类母核RCONONHSCH2R1COOH7-氨基头孢烷酸(7-ACA)酰胺侧链-内酰胺环酸性手性CSNH2CHONCOHNCH3COOH头孢氨苄(cefalexin)HSOHCH3ONNH2NHOHOH,H2OSNH2CHONCOHNCH3COOHHO头孢羟氨苄(cefadroxil)HSOHCH3ONNH2NHOHOHHO,H2OHSOHCH3ONNH2NHOHOHSNH2CHONCOHNCH3COOH头孢拉定(cefradine)SSCH2ONCOHNCH2OCOCH3COONaHNNOOHHSONaOOCH3OS头孢噻吩钠(cefalotin)(二)性质*与碱金属成盐易溶于水pKa=2.5~2.81.酸性羧基*与有机碱成盐难溶于水RCONSCH3CH3COOHOHNRCONONHSCH2R1COOH难溶于水易溶于有机溶剂青霉素易溶于水难溶于有机溶剂K+Na青霉素钾青霉素钠H溶解性NOS2.旋光性(5%头孢唑啉钠溶液–18~–24°)20D][手性CNSONOS3.UV共轭体系NSO4.不稳定性水溶液不稳定、易开环失效干燥纯净较稳定-内酰胺环四元环张力大酰胺键易水解不稳定性因素RCONSCH3CH3COOHOHNRCONONHSCH2R1COOH降解、失效青霉素类酸、碱、青霉素酶温度↑氧化剂(头孢噻吩钠水溶液25℃24h失活8%)降解、失效头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶(青霉素钠水溶液30℃24h失活56%)Cu2+、Pb2+、Hg2+、Ag+青霉素的降解反应青霉烯酸pH4pH2脱羧青霉噻唑酸H+△-CO2青霉素青霉噻唑酸OHˉHgCl2HgCl2△青霉二酸H+or醇青霉胺orHgCl2H+青霉醛+H+△不同pH条件下青霉素钠降解情况24℃0.41.4129233621812531.29.31.4半衰期(h)234567891011pH温度对青霉素钠稳定性的影响pH2,30′温度℃52637↓%67797二、鉴别试验(一)呈色反应1.羟肟酸铁反应内酰胺羟肟酸衍生物头孢菌素类青霉素类盐酸羟胺OH-红、棕、褐色Fe3+/3H+CNSNHOOHHClNOHH2OH-Fe3+/3H+CNSNHOOFe3+3红、棕、褐NSO例磺苄西林钠Ch.P(2005)【鉴别】(1)取本品约20mg,加水15ml溶解后,加盐酸羟胺试液与氢氧化钠试液各2ml,放置5分钟后,加盐酸溶液(1→100)3ml与三氯化铁试液1ml,随即振摇,即显赤褐色。例头孢哌酮Ch.P(2005)【鉴别】(1)取本品约10mg,加水2ml与盐酸羟胺溶液[取34.8%盐酸羟胺1份,醋酸钠-氢氧化钠溶液(取醋酸钠10.3g与氢氧化钠86.5g,加水溶解使成1000ml)1份,乙醇4份,混匀]3ml,振摇溶解后,放置5分钟,加酸性硫酸铁铵试液1ml,摇匀,显红棕色。2.类似肽键的反应双缩脲反应碱性酒石酸铜内酰胺类紫色开环,[H]例阿莫西林Ch.P(1995)【鉴别】(2)取本品约10mg,加水6ml溶解后,加碱性酒石酸铜试液0.5ml,即显紫色。例氨苄西林钠Ch.P(1995)【鉴别】(1)取本品约10mg,加水6ml溶解后,加碱性酒石酸铜试液0.5ml,即显紫色。茚三酮反应茚三酮内酰胺类△蓝紫色CCOCNOCOCC氨基酸结构类似例阿莫西林Ch.P(2000)【鉴别】(4)TLC法对照品法显色剂0.3%茚三酮-乙醇溶液(90℃加热15分钟)3.其他呈色反应*与重氮苯磺酸盐反应*与变色酸-硫酸反应*H2SO4-HNO3反应*与铜盐反应1.K+、Na+的火焰反应附录ⅢK+火焰→紫色+0.1%四苯硼钠+HAc→↓白(二)各种盐的反应Na+火焰→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓例青霉素钠Ch.P(2005)【鉴别】(4)本品显钠盐的火焰反应(附录Ⅲ)。例青霉素钾Ch.P(2005)【鉴别】(3)本品显钾盐的火焰反应(附录Ⅲ)。2.重氮化-偶合反应芳香第一胺类反应普鲁卡因青霉素重氮化红色↓HClNaNO2普鲁卡因青霉素碱性β-萘酚(偶合)例普鲁卡因青霉素Ch.P(2000)【鉴别】(3)本品显芳香第一胺类的鉴别反应(附录Ⅲ)。3.沉淀反应白青霉素青霉素钠 青霉素钾 H碱金属盐溶于过量HCl或有机溶剂例青霉素钠青霉素钾Ch.P(2000)【鉴别】(2)取本品约0.1g,加水5ml溶解后,加稀盐酸2滴,即生成白色沉淀;此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸中溶解.(三)光谱法1.IR法1OCcm1740~1815Vβ-内酰胺环上的羰基伸缩振动增强而向高波数方向位移例青霉素钠Ch.P(2005)【鉴别】(2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱(光谱集222图)一致。例青霉素钾Ch.P(2005)【鉴别】(2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱(光谱集223图)一致。2.UV-Vis法A/AEminmax%1cm1光谱图样品或分解产物青霉素V钾268、2741.20~1.25头孢唑林钠272264~292头孢氨苄262220~245max%1cm1E头孢噻肟钠262400~440A/Anm339HA苯唑青霉烯酸苯唑青霉素钠Cu2+pH3.8△CNCH3ONOOHNCH3CH3SHCOOHNOCONHCH3NOSCH3CH3COONa△Cu2+(四)色谱法1.TLC法2.HPLC法对照品法比较Rf和斑点颜色比较tR例头孢拉定Ch.P(2005)【鉴别】(1)取本品与头孢拉定对照品适量,分别加水溶解并稀释制成每1ml中约含6mg的溶液.作为供试品溶液和对照品溶液,照薄层色谱法(附录ⅤB)试验,吸取上述两种溶液各5ml,分别点于同一硅胶G薄层板上,以0.1mol/L枸橼酸溶液-0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-丙酮(60:40:1.5)为展开剂,展开,于105℃加热15分钟后,检视,供试品溶液所显主斑点的颜色与位置应与对照品溶液所显主斑点的颜色与位置相同。例头孢拉定Ch.P(2005)【鉴别】(2)在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。例头孢氨苄Ch.P(2005)【鉴别】(1)在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。(2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱(光谱集1090图)一致。(五)微生物检定法例青霉素钠Ch.P(2000)【鉴别】(1)取本品与已知含量的青霉素适量,分别加水制成每1ml中约含50mg的溶液,各取1ml,加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml,在37℃灭活1小时后,取灭菌滤纸片,分别用上述溶液浸湿后,用滤纸吸去多余的液体,置摊布金色黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培养基上,在37℃培养约16小时后均无抑菌作用,而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。对照品对照法三、特殊杂质的检查*高分子聚合物*吸光度杂质*有关物质*异构体例青霉素钠【检查】青霉素聚合物例青霉素钾【检查】青霉素聚合物例阿莫西林【检查】阿莫西林聚合物(青霉噻唑蛋白+青霉素、青霉噻

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