3 电泳技术(基础医学与医学实验技术)

第五章电泳技术Electrophoresis基础医学院刘芸1内容提纲纸电泳凝胶电泳等电聚焦电泳荧光差异双向电泳技术（DIGE）毛细管电泳技术电泳技术概论3132常用电泳技术2一、定义电泳：带电粒子在直流电场中向着与其本身所带电荷电性相反的电极移动的现象。电泳技术：生物样品在电泳过程中因各组分的移动快慢不同而被分离的技术。利用电泳现象进行物质分离的技术。第一节电泳技术概论34二、电泳分析技术发展概况1809年发现电泳现象1937年Tiselius自由界面电泳1948年Wieland滤纸电泳1959年聚丙烯酰胺凝胶电泳1980’s毛细管电泳(capiliaryelectrophoresis)ArneWilhelmKaurinTiselius蒂塞利乌斯(瑞典人)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖19485三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳2.根据电泳电压的高低常压电泳100～500V高压电泳500～10kV6①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳—使用支持物(1)按支持物的物理性状不同，可分为7(2)按支持物的装置形式不同，可分为①平板式电泳②垂直板式电泳③垂直柱式电泳891011121314连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如PAGE、IFE。优点：在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。4.根据电泳系统pH是否连续，可分为15四、电泳技术的特点凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.16五、电泳技术应用临床诊断进行血清蛋白、血红蛋白、精蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定以及血清学酶的检验、免疫化学检验等。工业制造用于提纯酶、激素及其它生化产品基础理论研究从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。17六、电泳的基本原理悬浮或溶解在电解质溶液中的带电粒子，在电场作用下以不同的速度向着与自身所带电荷极性相反的电极移动。在电泳过程中，带正电荷的粒子向电场的负极方向移动，带负电荷的粒子向电场的正极方向移动。移动的带电粒子受到电场力和周围介质阻力的作用，当二力平衡时，粒子以稳定的速度向电极方向移动。由于电荷、质量等的差异，粒子将会有不同的质/荷比，使其在电场中具有不同的迁移速度。18以蛋白质分子为例:（q：有效电荷，E：场强）F=Eq电场力：F’=6rv（F’：摩擦阻力，v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的移动速度）阻力：19VqM=———=————E6rEqv=————6rEq=6rvF=F’迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。20七、影响电泳速度的因素1.电场强度（E）E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降常压电泳100～500V1V/cm~10V/cm高压电泳500～10kV20V/cm~200V/cm21溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢2.离子强度（I）221iiZmI（m：离子的摩尔浓度，Z：离子的价数）对于稀溶液：22pH值决定了化合物解离的程度，也决定了物质所带的净电荷。3.缓冲液的pH23氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）pH=pI净电荷=0pHpI净电荷为正pHpI净电荷为负NH2CHRCOOHNH3+CHRCOOCHRCOONH3++H++OH-+H++OH-(pK´1)(pK´2)等电点(isoelctricpoint)：当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值。24---------------+++++++++——————————+++++++++（液）---------------负极←→正极4.电渗效应电渗（electro-osmosis）——指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。255.分子筛在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。6.温度电泳时电流通过支持介质会产生热量。按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）26第二节常用电泳技术（一）纸电泳滤纸电泳（paperelectrophoresis）——是指用滤纸作为支持载体的电泳方法。滤纸水平地架设在支持板上。把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。27薄膜电泳（衍生）支持体：薄膜优点：1.吸附作用小；2.电渗作用小；3.需加样量少；4.亲水性小应用：广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析MagnificationofCelluloseAcetatefilter28支持物：多孔凝胶。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高。（二）凝胶电泳凝胶电泳（agarosegelelectrophoresis）——是指用凝胶物质作为支持载体的电泳方法。最常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳2930SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳不受蛋白质原有电荷影响，主要取决于蛋白质及其亚基分子量大小的方法，可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。31基本原理SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）32SDS-PAGE是一个不连续系统，由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶（pH6.8，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。分离胶（pH8.8，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）33不不连连续续凝凝胶胶电电泳泳的的分分离离原原理理：：11、、样样品品的的浓浓缩缩效效应应11））凝凝胶胶层层的的不不连连续续性性22））缓缓冲冲液液离离子子成成分分的的不不连连续续性性22、、电电荷荷效效应应各各种种蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷不不同同，，有有效效迁迁移移率率也也不不同同33、、分分子子筛筛效效应应凝凝胶胶浓浓度度不不同同，，网网孔孔径径大大小小不不同同。。分分子子量量和和构构型型不不同同的的蛋蛋白白质质分分子子，，通通过过一一定定孔孔径径的的凝凝胶胶时时所所受受阻阻力力不不同同，，引引起起泳泳动动速速度度的的变变化化，，从从而而达达到到分分离离目目的的。。影影响响因因素素：：11、、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶孔孔径径的的大大小小22、、缓缓冲冲系系统统33、、离离子子强强度度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）34PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）即聚丙稀酰胺是由丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）激发的。丙烯酰胺浓度％线性分离范围kDa1510~431212~601020~807.536~945.057~212SDS-PAGE的有效分离范围SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）35考马斯亮染色银盐染色SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）36琼脂糖凝胶电泳（Agarosegelelectrophoresis）琼脂糖Agarose，缩写为AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。是一种天然的线状高分子，是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖和3，6-脱水-L半乳糖。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌处理。37琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳（Agarosegelelectrophoresis）这类载体能使被筛分的物质保持活性，并能迅速活化并接上各功能基团，架构疏松，孔径大，是一种很好的电泳凝胶，刚性比聚丙烯酰胺大。38（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性琼脂糖凝胶电泳（Agarosegelelectrophoresis）39（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。琼脂糖凝胶电泳（Agarosegelelectrophoresis）（三）应用1.适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化2.临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测3.为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标40基本原理pH为8.3－8.0时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸41基本操作步骤：配置融化琼脂糖安装梳齿加入染料拔除梳齿加入电泳缓冲液上样并电泳紫外灯下观察例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸42常用仪器设备例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸43常用仪器设备例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸44（三）等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectricfocusingelectrophoresis，IEF）——是指电泳系统中加进两性电解质载体，当通以直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。样品（蛋白质等）进入时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。45优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白质或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。等电聚焦电泳的特点46等电聚焦电泳的基本原理蛋白质具有许多可解离的酸性基团（－COOH）和碱性基团（－NH2）及其它基团，在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相