细胞生物学实验技术

第三章细胞生物学研究方法PreparatoryobserveputforwardtheoreticsDesigncontroltestsCollectdataExplainresultsDeviseconclusionRefertoknowledgeHowcellsarestudied你要脚踏实地从事研究并如实报告观察结果；同时也要保持健康长寿。1983年McClintockB.才获得诺贝尔生理医学奖。你也有可能获诺贝尔奖1938年提出“转座子”概念；1944-1950年提出DSAC调控系统（玉米籽粒或叶片色泽调控系统：C←DS←AC）；1951年提出“跳跃基因”学说。1965年诺贝尔获奖者为提出与DSAC调控系统非常相似的大肠杆菌乳糖操纵子模型的F.Jacob和J.L.Monod。1976年在冷泉港召开的“DNA插入因子、质粒和游离基因”专题讨论会上，她才是基因调控“操纵子理论”的先驱。FluoresceinThelocationofDNAandproteinswithinthesamecell.DNA—blueTubulin—greenActin—redGolgi—yellowMitochondria—purpleTechniquesinCellBiology第一节细胞形态结构的观察方法（细胞水平——光镜和电镜）第二节细胞组分的分析方法（分子水平——细胞组分分离与纯化）第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术（研究工具——基因表达与表观遗传）第四节用于细胞生物学研究的模式生物（细胞是生命的基本单位）第一节细胞形态结构的观察方法普通光镜特殊光镜形态观察扫描式电子显微镜扫描隧道电子显微镜透射式电子显微镜冰冻蚀刻技术紫外光显微镜暗视野显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜电子显微镜光学显微镜的分辨率与放大倍数：物像是否清楚不在于放大倍数的多少，而是决定于显微镜的分辨率（resolution）大小。即能够清楚区分两个质点之间的最小距离，称为分辨率。第一节细胞形态结构的观察方法显微镜是观察细胞的主要工具人眼——0.2mm光学显微镜（可见光、紫外光）——0.2μm。细胞核、线粒体、核仁和染色体的直径大于0.2μm的显微结构。电子显微镜（电子束）——0.2nm。病毒核糖体、球形蛋白、小分子、内质网膜、核膜、微管、微丝等小于0.2μm的亚显微结构。第一节细胞形态结构的观察方法分辨率公式N.A.0.612λD2αinnN.A.sλ波长可见光760-380nm紫外光380-180nmx射线13-0.05nm电子束(1万伏)0.0122nm第一节细胞形态结构的观察方法NA＝n•sin（α/2）n=介质的折射率；α=镜口角：标本对物镜镜口的张角，≤140°。数值孔径（numericaperture）与镜口角（α）的关系介质空气水香柏油α-溴萘折射率（n）11.331.5151.66第一节细胞形态结构的观察方法放大倍数=显微镜的分辨率人肉眼的分辨率0.2m可见紫外光源波长(nm)oD90sin68.110550612.03限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，一般光学显微镜的最大放大倍数为1000~1500。小于0.2m的一些细微结构，称为亚显微结构(submicroscopicstructure)或超微结构(ultrastructure)，在光学显微镜下无法看清。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。第一节细胞形态结构的观察方法目镜物镜聚光器载物台光源结构组成:（一）普通光学显微镜①照明系统（光源、聚光器）②光学放大系统（物镜、目镜）③机械装置（载物台）第一节细胞形态结构的观察方法2图像样品光线聚光器物镜光学显微镜的光路图第一节细胞形态结构的观察方法移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片切片机(microtome)第一节细胞形态结构的观察方法细胞厚度一般有20~30µm，无法看清楚一个完整的一个细胞。标本制备：包括固定、包埋、切片、脱蜡和染色过程细胞结构呈半透明状，不易看清（原因是什么），往往将标本切片进行染色，提高可辨程度。第一节细胞形态结构的观察方法染色的成像原理1.紫外光显微镜光源为波长介于180nm-380nm之间，分辨率可提高1倍，可见到普通光镜看不见的胶体颗粒。细胞中的核酸和一些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而可测定细胞核中的核酸含量。（二）特殊光学显微镜因紫外线不易穿透普通玻璃，只能用造价高的石英、萤石、碳酸锂等特殊材料制作透镜，故实用性较差。第一节细胞形态结构的观察方法2.暗视野显微镜光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。能见小于4~200nm的微粒子，如核、线粒体清晰可见，分辨率比普通光镜提高50X。中央遮光板第一节细胞形态结构的观察方法视野的背景黑物体的边缘亮聚光器的设计原理：第一节细胞形态结构的观察方法暗视野显微镜光路图第一节细胞形态结构的观察方法明暗视场第一节细胞形态结构的观察方法3.相差显微镜1953年获诺贝尔物理奖1935年，荷兰物理学家F.Zernike研制发明，提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。因活细胞和未染色的细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），人眼无法观察。而相差显微镜通过改变相位差为振幅差，和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。第一节细胞形态结构的观察方法1．应用范围观察未经染色的活细胞、细胞核、线粒体介壳虫染色体TheimageofafibroblastinculturebyFourtypesoflightmicroscopy(A)bright-fieldmicroscopy（普通光镜）(B)phase-contrastmicroscopy（相差镜）(C)Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy（诺马斯基微分干涉差显微镜）(D)dark-fieldmicroscopy（暗视野显微镜）第一节细胞形态结构的观察方法观察未经染色的玻片标本第一节细胞形态结构的观察方法基本原理相位：某一时间振动点在振动周期中的位置。相位差：两束光波在同一时间的相位差距。（1）相位和相位差第一节细胞形态结构的观察方法（2）相干波的相位差与振幅的关系当两束波的相位差等于零（或等于的整数倍时），其合成波的振幅为两束波振幅之和——相长干涉。振幅A3=A1+A2，亮度加强。当两束相干波1、2相遇时可能发生干涉形成合成波3当两束波的相位差为/2时，合成波振幅为两波振幅之差——相消干涉。振幅A3=A1-A2，亮度减弱。第一节细胞形态结构的观察方法（3）相差显微镜的工作原理光通过密度大的物质时，光的滞留时间长，密度小的滞留时间短。相差显微镜可将这种光程差或相位差转换成振幅差，从而使标本密度不同的区域转换成亮度明暗的差异。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。第一节细胞形态结构的观察方法光线透过标本后发生衍射，偏离了原来的光路，同时波长被延迟了1/4λ;如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为0λ或1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，增强反差。第一节细胞形态结构的观察方法相差显微镜有2个特殊构造1.环形光阑annulardiaphragm2.相位板annularphaseplate第一节细胞形态结构的观察方法上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后1/4λ光程差。环形光阑环形相板使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。第一节细胞形态结构的观察方法相差显微镜的光路图解根据设计：只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其它部分通过。两组光线和轴后发生干涉现象。第一节细胞形态结构的观察方法S+DSD凸形相板-1/4λ+1/4λ两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）——标本结构比周围介质更加变亮。第一节细胞形态结构的观察方法S-DSD凹形相板通过样品的光线延后1/4λ-1/4λ-1/4λ两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）——结构比周围介质更加变暗。第一节细胞形态结构的观察方法4.微分干涉差（DIC）显微镜DIC显微镜是Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的，又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示三维立体结构的投影影像。第一节细胞形态结构的观察方法DIC显微镜的应用1.标本可略厚一点，折射率差别更大。2.适合于如核、线粒体等立体感特别强的细胞器的显微操作。3.基因注入、核移植、转基因等的显微操作。第一节细胞形态结构的观察方法计算机辅助DIC显微镜Extendingthelimitsofdetection.Light-microscopeimagesofunstainedmicrotubulesthathavebeenvisualizedbydifferential-interference-contrastmicroscopyfollowedbyelectronicimageprocessing.(A)Theoriginalunprocessedimage.(B)Thefinalresultofanelectronicprocessthatgreatlyenhancescontrastandreducesnoise.（Electronicimageprocessing）第一节细胞形态结构的观察方法观察微管上颗粒的运动情况ObservinglivingspecimensGreatlyincreasethecontrastofanimagesothatverysmallobjectsbecomevisible录像增差显微镜技术（Video-enhancecontrastmicroscopy第一节细胞形态结构的观察方法BFDICRC光镜下的7种观察方式PHDFFLPOL第一节细胞形态结构的观察方法5.荧光显微镜利用较短波长的光使标本受到激发产生较长波长的荧光成像而被观察到。观察和分辨标本中某些物质的分布、性质和数量的显微镜。是目前在光镜水平上对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具之一。第一节细胞形态结构的观察方法Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.光学原理第一节细胞形态结构的观察方法第一节细胞形态结构的观察方法自发荧光（物质分子本身）叶绿素+UV红色荧光纤维素+UV黄色荧光间接荧光（物质分子+荧光染料）酸性品红、吖啶橙、甲基绿、刚果红)+UV荧光如：RNA+吖啶橙橙色荧光DNA+吖啶橙绿色荧光荧光的发生第一节细胞形态结构的观察方法荧光染料（Fluorescentdyes）Thestructuresoffluoresceinisothiocyanate（FITC,异硫氰酸荧光素）andtetramethylrhodamineisothiocyanate（TRITC，四甲基异硫氰酸罗丹明）,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.FITCemitsgreenlight,whereastheTRITCemitsredlight.第一节细胞形态结构的观察方法荧光探针:荧光素、荧光抗体Tubulin呈绿色、Actin红色、Nuclei蓝色第一节细胞形态结构的观察方法分裂细胞的免疫荧光图像不同荧光染料标记抗体抗原(细胞的蛋白质成分)特异性结合荧光抗体第一节细胞形态