树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究张恒辉何豫赵鸿朴文花刘茂昌席宏丽于敏王贵强北京大学第一医院感染疾病科研究背景HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常研究背景（1）特异性CTL数量少低反应HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常促进DC成熟、恢复DC的功能增强DC激活特异性抗病毒免疫反应打破免疫耐受彻底清除病毒研究背景（1）特异性CTL数量少低反应获得高频数、功能强HBV特异性的CTL促进DC成熟，增强DC功能CpGCD40LAd-IL-12转染Poly（I：C）关于恢复DC功能的研究研究背景（2）研究目的本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能。将患者DC经HBVcore18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。研究对象和方法研究对象22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、HBeAb+患者6例。HBVDNA均≥104copy/ml。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。研究方法HLA-A2型别鉴定DC的体外培养扩增及鉴定以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数MHC-肽四聚体检测HBVcore18-27肽特异性CD8+T细胞HLA-A*02型别鉴定外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗；流式细胞仪检测；每份标本均设自身阴性对照。树突状细胞的体外培养扩增及鉴定分离病人PBMC；GM-CSF、IL-4刺激下DC培养转化；Poly(I:C)刺激；通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞培养成熟DC负载HBV核心肽（HBVcore18-27FLPSDFFPSV）；DC与自体T细胞共培养48-72h；单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数封闭种板孵育：37℃，5%CO2孵育15-20h；显色计数：CTLIMMUNOSPOT分析仪计数，取两复孔的平均值MHC-肽四聚体检测HBVcore18-27肽特异性CD8+T细胞PE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和FITC-鼠抗人CD8标记；流式细胞仪检测；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV四聚体标记作为阴性对照；统计学处理实验数据以x±SD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。结果DC的扩增、表型鉴定及Poly(I:C)对其表面分子表达的影响组别例数HLA-DR+CD80+CD83+CD86+CD14+CD11c+未加Poly(I:C)组2283.6±6.923.4±6.619.3±2.284.2±6.38.4±2.895.5±3.1Poly(I:C)作用组2288.8±7.839.3±8.6*30.7±5.6*85.4±3.23.7±2.3*93.4±2.9慢性乙型肝炎病人DC经Poly(I:C)作用前后表面分子表达的比较*表示差异有统计学意义（P0.01）经Poly(I:C)刺激后：CD80、CD83表达明显上调。CD14的表达明显下降。Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-γ的CTL细胞频数的比较1231.慢乙肝病人体外经IL-2维持生长的T细胞；2.经自体DC刺激后的T细胞；3.DC经Poly（I:C）作用后刺激的T细胞树突状细胞激活的分泌IFN-γ的CTL细胞的频数分布图T：慢性乙型肝炎患者体外经IL-2维持生长的T细胞；DC-T：经树突状细胞刺激后的T细胞；PDC-T：树突状细胞经Poly（I:C）作用后刺激的T细（“━”表示均数）Elispot检测结果说明病人T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，分泌IFN-γ的CTL细胞频数均值由16上升为46，约为2.9倍；发现经Poly（I:C）作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高，均值为98，和未经树突状细胞刺激组和树突状细胞刺激组相较，分别升高6.1和2.1倍。Tetramer流式细胞技术检测HBVcore18-27特异性CD8+T细胞结果PE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和FITC-鼠抗人CD8标记T细胞，行流式检测。以淋巴细胞设门，收集门内细胞50,000个,右上象限细胞数/右上及右下象限细胞数之和即为抗原特异性CTL占CD8+细胞数比例（图中右上象限的百分比值）。1．PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8标记的T细胞；2.IL-2维持的自身T细胞；3.与树突状细胞作用的T细胞；4.与poly（I︰C）刺激后的树突状细胞作用的T细胞图3.tetramer检测特异CD8+T细胞的频数分布图Control：非相关肽四聚体标记的T细胞；T：IL-2维持的自身T细胞；DC-T：与树突状细胞作用的T细胞；PDC-T：与poly（I︰C）刺激后的树突状细胞作用的T细胞。Tetramer结果说明患者T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，HBVcore18-27肽特异的CTL频数均值由0.77%上升至1.92%，提高约2.5倍，差异均有统计学意义（P＜0.001）。经Poly（I:C）刺激的树突状细胞活化后，HBVcore18-27表位特异性CTL的频数均值上升为3.49%，分别为前2组的4.5和1.8倍，差异均有统计学意义（P值均小于0.001）。讨论讨论（1）树突状细胞能激活幼稚T细胞，调节T、B淋巴细胞的功能；在病毒抗原摄取、递呈及特异性激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，是抗感染免疫的中心环节。HBV急性感染时：多克隆、高反应性的病毒特异性CTL——可迅速、彻底清除病毒；HBV慢性感染时：单一克隆、弱反应性的病毒特异性CTL。讨论（2）聚肌胞Poly(I:C)是一种Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的强诱生剂。Poly（I:C）能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状细胞成熟，并维持树突状细胞的成熟状态。CD83：DC成熟；行使功能CD83表达DC成熟及功能改善CD14：单核细胞的特异性分子标记CD14表达DC分化程度改善讨论（3）MHC-肽四聚体染色法检测HBVcore18-27特异性CTL的数量：高特异性、敏感性对特异性CTL进行定性、定量分析用于感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的细胞免疫学研究和治疗效果监测。Elispot检测活化的分泌IFN-γ的有功能的病毒特异性T细胞两种技术结合能够更准确、客观地评价体外转化的树突状细胞活化特异性T淋巴细胞的能力。结论慢性乙型肝炎患者T细胞在体外经自身负载HBVcore18-27抗原肽的DC刺激后，可获得高频数、功能较强的HBV特异性的CTL；在DC体外转化的过程中加入聚肌胞作为刺激剂可明显促进DC的成熟、增强DC功能，在负载HBVcore18-27抗原肽后与自身T细胞作用可获得频数更高及功能更强的病毒特异性的CTL。Thankyou!