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1.3、1.4基因工程的应用蛋白质工程的崛起一、基因工程的应用成果1．乳腺生物反应器与微生物生产的比较类型项目乳腺生物反应器微生物生产基因结构动物基因结构与人类基因结构相同与人类基因结构不同基因表达与天然蛋白质活性没有区别由于可能缺少内质网、高尔基体等细胞器，产物可能不具有生物活性类型项目乳腺生物反应器微生物生产产物提取从乳汁中较易分离提取从细胞中提取，较为复杂生产设备畜牧业生产，加提取设备工业生产，设备精良乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。2．基因治疗(1)成果：将腺苷脱氨酶基因转入患者淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。(2)方法：①体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，如T淋巴细胞，进行培养。然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞进行扩增培养，最后重新输入患者体内。②体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。如1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者肺组织中。(3)基因治疗的过程(以镰刀型细胞贫血症的治疗为例)①用限制性核酸内切酶从人的DNA分子中切取血红蛋白基因。②用同一种限制性核酸内切酶在载体DNA上切开一个切口，用DNA连接酶将正常血红蛋白基因连接在载体DNA上，形成重组载体。③将携带正常血红蛋白基因的重组载体导入患者的造血干细胞中，并将重组载体插入到染色体DNA上。用选择培养基筛选出含重组质粒的造血干细胞。④将携带正常血红蛋白基因的造血干细胞输入患者骨髓中，此造血干细胞产生含正常血红蛋白的红细胞，以根治镰刀型细胞贫血症。二、蛋白质工程1．蛋白质工程的基本原理2．蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)项目蛋白质工程基因工程区别结果生产自然界没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下：(1)实验步骤①所代表的反应过程是_______。(2)步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性内切酶和______酶，后者的作用是将用限制性内切酶切割的_______和_____连接起来。(3)如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能_____，也不能__________。(4)为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用____与_____进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。(5)步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________(相同，不同)，根本原因是________________。【解析】此题以免疫知识为背景，实则考查基因工程的相关知识。SARS病毒的遗传物质是RNA，其遗传信息的表达首先需在宿主细胞内进行逆转录合成相应的DNA。利用这一点用逆转录的方法可获得控制产生S蛋白的基因(目的基因)。目的基因的剪接需要工具酶——限制性内切酶和DNA连接酶。一般用同种限制酶分别切割目的基因和运载体后，用DNA连接酶将二者连接起来。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这是因为目的基因在受体细胞内是不能单独稳定存在并表达的。利用抗原—抗体反应可以检测蛋白质，因此要检测基因工程产物是否与病毒的S蛋白有相同的免疫反应特性，可以用病人康复后血清中提取的抗S蛋白抗体与基因工程产生的蛋白质进行抗原—抗体反应实验。相同的目的基因导入不同的受体，由于基因携带的遗传信息相同，不同的生物又共用一套遗传密码，所以合成蛋白质的氨基酸序列是相同的。【答案】(1)逆转录(2)DNA连接载体S基因(3)复制合成S基因的mRNA(4)大肠杆菌中表达的S蛋白SARS康复病人血清(5)相同表达蛋白质所用的基因相同(2009年广东高考题)(1)饲料加工过程温度较高，要求植酸酶具有较好的高温稳定性。利用蛋白质工程技术对其进行改造时，首先必须了解植酸酶的______，然后改变植酸酶的____，从而得到新的植酸酶。(2)培育转植酸酶基因的大豆，可提高其作为饲料原料时磷的利用率。将植酸酶基因导入大豆细胞常用的方法是_____。请简述获得转基因植株的完整过程。_________________。(3)为了提高猪对饲料中磷的利用率，科学家将带有植酸酶基因的重组质粒通过_____转入猪的受精卵中。该受精卵培养至一定时期后可通过________方法，从而一次得到多个转基因猪个体。(4)若这些转基因动、植物进入生态环境中，对生态环境有何影响？【解析】(1)蛋白质工程首先要根据已有蛋白质，从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，合成目的基因，再通过基因工程产生转基因生物。(2)将目的基因导入植物细胞的方法有：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，其中有80%的转基因植物都是通过农杆菌转化法产生的。(3)动物细胞核的全能性受细胞质的抑制，故目的基因需注入到受精卵中，再将注射了目的基因的受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成具有新性状的动物。(4)转基因生物可造成基因污染等不良影响。【答案】(1)分子结构及预期功能基因(2)农杆菌转化法首先将目的基因与质粒组合，构建基因表达载体，将含目的基因的表达载体导入植物细胞，通过植物组织培养获得表现新性状的植物。(3)显微注射法胚胎分割(4)转基因生物及其产品对生物多样性、生态环境可能产生的影响主要表现在以下几方面：①转基因生物打破了物种的原有界限，改变了物质循环和能量流动，对生态系统的稳定性造成破坏；②重组DNA与微生物杂交，可能出现对动、植物和人类有害的病原微生物；③增加目标害虫的抗性和进化速度；④转基因植物通过传粉进行基因转移，导致超级杂草出现；⑤转基因植物的花粉如含有有毒蛋白或过敏蛋白，通过蜜蜂的采集，很可能进入蜜蜂中，再经过食物链的传递，最后有可能进入其他动物和人体内。1．(2009年安徽高考题)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是()A．追踪目的基因在细胞内的复制过程B．追踪目的基因插入到染色体上的位置C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构【解析】绿色荧光蛋白基因指导合成的蛋白质为绿色荧光蛋白，该基因与目的基因组成的融合基因指导合成的蛋白质即含有绿色荧光蛋白，故绿色荧光蛋白基因可用来追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。【答案】C2．(2008年高考上海卷)以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题：(1)获得目的基因的方法通常包括________和________。(2)切割和连接DNA分子所使用的酶分别是________________和______________。(3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或____________，后者的形状呈________。(4)由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率________，所以在转化后通常需要进行________操作。(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和________序列上是相同的。【解析】该题考查基因工程的操作，属于记忆性的内容，见答案。【答案】(1)化学合成(人工合成)酶切获取(从染色体DNA分离/从生物细胞分离)(2)限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶(连接酶)(3)质粒小型环状(双链环状、环状)(4)低筛选(5)氨基酸3.(2008年海南高考)右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。据图回答：(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_________、________、________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行________。(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是__________。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是______，其合成的产物是________。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是____________________。【解析】在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA片段的连接。将切割后的目的基因和质粒，用DNA连接酶进行连接，它们之间随机连接，可有三种产物：目的基因—载体连接物、载体—载体连接物和目的基因—目的基因连接物。从图中可以看出，目的基因的插入位点在抗四环素基因上，可推知：目的基因—载体连接物的抗四环素基因被破坏，丧失了抗四环素的能力，但保留了抗青霉素的能力；载体—载体连接物既保留了抗四环素的能力也保留了抗青霉素的能力；目的基因—目的基因连接物既无抗青霉素基因也无抗四环素基因，不具备抗性。获得DNA连接产物以后，必须通过筛选方能获得所需的基因表达载体。导入宿主细胞后方能表达获得基因产物。目的基因表达过程中，RNA聚合酶首先与启动子结合，指导目的基因转录产生mRNA，mRNA再指导蛋白质的合成。从图中可看出抗四环素基因上有两个不同的切割位点，所以在实际操作过程中，为避免切割后的末端任意连接，可用EcoRⅠ和BamHⅠ同时对目的基因和质粒进行切割，使同一切割产物的黏性末端不同。【答案】(1)目的基因—载体连接物载体—载体连接物目的基因—目的基因连接物分离纯化(2)载体—载体连接物目的基因—载体连接物、载体—载体连接物(3)启动子mRNA(4)EcoRⅠ和BamHⅠ4.(2009年宁夏高考题)多数真核生物基因中编码蛋白质的序列被一些不编码蛋白质的序列隔开，每一个不编码蛋白质的序列称为一个内含子。这类基因经转录、加工形成的mRNA中只含有编码蛋白质的序列。某同学为检测某基因中是否存在内含子，进行了下面的实验：步骤①：获取该基因的双链DNA片段及其mRNA；步骤②：加热DNA双链使之成为单链，并与步骤①所获得的mRNA按照碱基配对原则形成双链分子；步骤③：制片、染色、电镜观察，可观察到图中结果。请回答：(1)图中凸环形成的原因是___，说明该基因有_____个内含子。(2)如果现将步骤①所获得的mRNA逆转录得到DNA单链，然后该DNA单链与步骤②中的单链DNA之一按照碱基配对原则形成双链分子，理论上也能观察到凸环，其原因是逆转录得到的DNA单链中不含有____序列。(3)DNA与mRNA形成的双链分子中碱基配对类型有