第七章 生物技术与食品安全和品质控制

第七章生物技术与食品安全和品质控制第一节生物传感器及其在食品检测分析中的应用由固定化的具有分子识别功能的生物材料、换能器和信号处理放大装置组成的分析工具或系统。（一）生物传感器的基本组成和分类1.生物传感器的基本组成生物识别元件：生物传感器中固定化的酶、微生物细胞、抗原抗体和组织切片等具有分子识别能力的生物敏感材料。换能器：能将在生物敏感材料上进行的生化反应产生的各种信息转换成电信号的装置。信号处理装置：负责信号的分析处理和放大输出。一、生物传感器的基本概念2.生物传感器的分类根据生物敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、细胞传感器、组织传感器和DNA传感器。根据换能器的不同，可分为电化学传感器、介体生物传感器、测光型生物传感器、测热型生物传感器等。具体到某一种传感器的命名，一般是采用“功能+结构特征”的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纤传感器等。（二）生物传感器的工作原理通过生物的分子识别作用，生物传感器中的生物敏感材料和生物样品中的待测物质特异性结合，并进行生物化学反应，产生离子、质子和质量变化等信号，信号的大小在一定条件下和样品中被测物质的量存在一定的关系，这些信号经换能器转换成电信号，电信号再经信号分析处理系统处理后输出，反映出样品中被测物质的量。转换器敏感元件待测物生物传感器的模型1.分子识别（molecularrecognition）生物传感器中的分子识别:指生物敏感材料中生物分子能选择性地和待测样品中的待测成分进行特异性（选择性）结合的性质。生物敏感材料包括酶、抗原（体）等免疫物质、微生物细胞和DNA等。酶的分子识别:指酶分子只能和特定的底物分子进行结合，而不能和其他分子结合的特性。酶分子的识别能力主要是由酶的活性中心决定，其决定了以酶为生物敏感材料的生物传感器的分子识别能力。免疫传感器的分子识别：由传感器上的生物敏感材料－抗原或抗体物质的分子识别能力决定，抗原和抗体象酶和底物一样也能发生特异性（选择性）结合。DNA传感器的分子识别：由DNA分子中碱基对的互补结合特性决定。2.生化反应中量的变化和信号的转换（1）热焓的变化及其转换（2）光效应及其转换（3）颜色的变化及其转化（4）阻抗的变化及其转换（5）生化反应中其他量的变化及其转化（6）直接产生电信号将化学变化转变成电信号酶传感器为例,酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器.常用转换装置有氧电极、过氧化氢。将热变化转换成电信号固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化.例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围.这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。将光信号转变为电信号过氧化氢酶,能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光,因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端,再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量。还有很多细菌能与特定底物发生反应,产生荧光.也可以用这种方法测定底物浓度。上述三原理的生物传感器共同点：都是将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应,将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量,这种方式统称为间接测量方式.直接产生电信号方式这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接(或通过电子递体的作用)在电极表面上发生.根据所得的电流量即可得底物浓度。3.生物放大（biologicalamplification）（1）酶催化放大酶是高效专一的催化剂，它可以在很短的时间内催化大量底物的转化，通过测定酶所催化反应中底物的减少量或产物的增加量可以推测（判断）反应中比底物减少量或产物增加量少得多的酶量，或与酶相关联的其他物质的量，从而实现生物放大作用。应用这一放大原理可以使检测方法的灵敏度（最小检出量）比常规检测方法提高2个数量级。（2）底物循环放大被测物S1或S2，在酶E1和酶E2之间不断循环，每循环一次，E1和E2都要分别消耗各自的底物C1和C2，产生对应的产物P1和P2，而循环过程中被测物S1和S2的浓度保持不变，通过分析C1和C2的消耗量或P1和P2的增加量就可以测定待测物S1或S2的量，实现放大效应。循环的次数越多酶消耗的底物和产生的产物越多，放大效率也越高（图）。（3）酶级联放大生物体内的有些酶（通常为酶原）本身是没有活性，在辅酶、另外一种酶或酶的变构效应物等激活剂的作用下，酶E1i被激活为酶E1a，E1a激活E2i成E2a，E2a又激活E3i或E3a，由于酶是催化剂可以连续使用，这样经过一系列的反应，一个分子的辅酶或变构效应物等激活剂就能够产生成千上万分子的E3a，然后E3a催化底物S3产生产物P3，通过测定底物的消耗量或产物的生成量就可以灵敏地测定辅酶或变构效应物等激活剂的量（图）。优点：效率极高，对提高生物传感器的灵敏度极为有效。缺点：在生物传感器中的应用条件较为苛刻。（4）脂质体技术脂质体：由类似于细胞膜的脂质膜构成的微球体，在微球体的内部包含有被酶、荧光素或电活性物质标记的抗原或抗体等标志物，微球体的外膜上结合有抗原（抗体），当外膜上的抗原（抗体）与待测的抗体（抗原）发生反应，并和补体结合时（或在表面活性剂的作用下），微球体破裂，微球体内的标志物被释放。标志物的量大且容易测定，通过测定标志物的释放量就可以测定出待测抗体（抗原）的量，从而实现生物放大（图）。缺点：目前还存在着微球体内的标志物容易渗漏和脂质体的稳定性较差等不足之处。（四）生物传感器的特点(1)根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛。(2)一般不需进行样品的预处理,它利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速,容易实现自动分析。(3)体积小、响应快、样品用量少,可以实现连续在位检测。(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反复多次使用(5)准确度高,一般相对误差可达到1%以内(6)可进行活体分析(7)传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪,因而便于推广普及(8)有的微生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生，能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。二、生物传感器中生物敏感材料的固定化和成膜技术（一）生物材料的固定化技术指通过物理或化学的方法将酶、微生物细胞和抗原抗体等生物材料限制在一定的区间内，使生物材料只能在特定的区间进行生化反应，而反应的底物和产物可以自由扩散的技术。生物材料常用的固定化方法包括：夹心法、吸附法、包埋法、交联法、共价结合法和微胶囊法等（图）。（二）成膜技术1.半导体生物传感器中的成膜技术（1）紫外线照射法（2）光平板印刷法（3）喷射法2.L-B膜技术三、生物传感器在食品安全和品质控制中的应用（一）农药和抗生素残留的分析1.农药残留的生物传感器检测目前有机磷农药中的马拉松、甲基马拉松、乙基马拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲酯类农药中的滴灭威、西维因、灭虫多和残杀威等农药在食品中残留量的生物传感器检测都有相应的研究报道。1996年余孝颖等采用离子敏场效应管为基础传感器（换能器），将乙酰胆碱酯酶通过戊二醛共价交联固定于场效应管上，制备得到了乙酰胆碱酯酶场效应管传感器，用于分析敌敌畏等有机磷农药的残留。原理：乙酰胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，当存在有机磷农药残留时，它们能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而使底物的分解减少，胆碱和乙酸的产生减少，其中乙酸的减少量可以通过离子场效应管来测定，且在一定条件下，乙酸的减少量和有机磷农药的量之间存在一定的比例关系，因此根据乙酸的减少量就可以计算出有机磷农药的残留。2.抗生素残留的分析青霉素和磺胺是兽药中常用的抗生素，其残留会污染动物性食品，从而对人类的健康造成危害。Sternesioes等人采用免疫传感器测定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，灵敏度达到1ng／g，传感器表面经NaOH和HCl处理后可以重复使用。Avon等用抗体酶共轭物为敏感材料结合光度分析法检测了牛奶中青霉素的含量。（二）食品添加剂的分析亚硫酸盐是常用的食品防腐剂和漂白剂，但是亚硫酸盐容易引起哮喘，美国FDA规定了其在新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过1×10-6mol／L。天冬酰苯丙氨酸甲酯，又称甜味素，是人工合成的低热量甜味剂。烟碱酸属于B族维生素，可以作为肉类食品的发色剂，但是人体摄入过量的烟碱酸会引起瘙痒和头痛等中毒症状，在日本已禁止使用。其他食品添加剂，如防腐剂苯甲酸钠、羟基苯甲酸钠、过氧化氢，抗氧化剂抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、儿茶酚、儿茶酚胺，发色剂亚硝酸，酸味剂磷酸和乳酸等都可以用相应的生物传感器来检测它们在食品中的含量。（三）污染微生物的检测污染食品的微生物可以分为腐败菌和病原菌。腐败菌主要是通过对食品成分的分解和破坏，同时产生有毒有害物质从而对人体造成危害。腐败菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破坏食品的组成成分外，其菌体本身也能使人致病。食品中污染微生物的检测方法通常是平板计数法，其操作繁琐，检测时间长，特别是对于病原菌的检测，有时长达l-2周才能出结果，因此各种快速检测方法不断涌现，生物传感器检测方法就是其中的一种。1.腐败菌的检测酿酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢杆菌等是常见的食品腐败菌。2.病原菌的检测常见的污染食品的病原菌有沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌等。这些病原菌按常规的检测方法检测时间很长，而采用生物传感器则能迅速地测定它们的数量。用来测定病原菌的生物传感器主要是光纤生物传感器、免疫生物传感器和DNA生物传感器。目前，上述病原菌都可以用相应的生物传感器来测定。（四）生物毒素的检测污染食品的生物毒素主要包括细菌毒素、真菌毒素、藻类毒素以及动植物毒素，其中以细菌毒素和真菌毒素最为常见。检测毒素的方法包括色谱法（气相色谱、液相色谱、薄层层析等）和生物学方法等，这些方法检测时间长，对样品的前处理复杂繁琐。以免疫学方法和生物传感器检测方法为代表的各种快速方法备受欢迎。1.细菌毒素的分析细菌毒素是由细菌分泌产生于细胞外或存在于细胞内的致病性物质，有内毒素和外毒素之分。内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分之一的脂多糖，热稳定，抗原性差，不能转化为类毒素，毒性比较弱，毫克水平才能引起动物死亡。外毒素：细菌（主要是革兰氏阳性菌，也有少数革兰氏阴性菌）分泌于胞外的一种蛋白质，热稳定性差，抗原性强，能转化成类毒素，毒性很强，微克水平就能引起动物死亡。目前研究报道主要集中在运用免疫生物传感器分析检测肉毒毒素和葡萄球菌肠毒素等细菌外毒素。运用生物传感器能灵敏、准确、快速地检测到它们在火腿和奶油等食品中的含量。2.真菌毒素的分析真菌毒素是真菌分泌产生的有毒次生代谢产物。常见的污染食品的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭霉素、杂色曲霉素、T-2毒素、腐马素、镰刀菌烯醇类毒素、展青霉素和橘霉素等。检测食品中污染真菌毒素的方法主要有薄层层析法和液相色谱法等。近二十多年来免疫学方法在真菌毒素的检测中得到了较好的应用，以此为基础的免疫生物传感器快速检测真菌毒素的方法也有研究报道和应用，其中以免疫传感器用于检测黄曲霉毒素B1和腐马素B1的研究报道最多。此外，也有运用微生物传感器和以纤毛虫为生物敏感材料的传感器检测展青霉素、黄曲霉毒素B1和T-2毒素的研究报道。3.其他生物毒素的检测也有用于检测食品中污染的动植物毒素。（五）食品新鲜度的分析1.鱼鲜度传感器鱼死亡后，鱼肉中ATP（三磷酸腺苷）在ATP酶的作用下分解成ADP（二磷酸腺苷），ADP在磷酸激酶的作用下分解产生AMP（一磷酸腺苷），AMP在AMP脱氨酶的作用下转化为IMP（肌苷酸），IMP在5’-核苷酸酶的作用下分解成HxR（肌苷），HxR在核苷磷酸化酶的作用下分解成Hx（次黄嘌呤），Hx在黄嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即：ATP→ADP→AMP→IMP→