唾液淀粉酶的制备

《生物化学实验》课程简介生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。目录实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法(操作性)4学时实验二考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度(操作性)3学时实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳(验证性)5学时实验四动物肝肝脏DNA的分离与鉴定(操作性)3学时实验五血液中葡萄糖的测定(操作性)3学时实验六血清中总胆固醇的测定(操作性)4学时实验七唾液淀粉酶活性的观察(综合性)4学时实验八维生素C的定量测定(操作性)4学时实验九脂肪酸的β-氧化(操作性)4学时实验十琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶(操作性)4学时实验十一酪蛋白的制备(操作性)4学时实验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定(综合性)3学时实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法【实验目的】1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。【实验原理】纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为：Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。【实验试剂与器材】1、溶剂系统（1）碱相溶剂：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（体积比）（2）酸相溶剂：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比）2、显色贮备液：0.1%水合茚三酮丙酮溶液3、V（0.1%硫酸铜）:V（75%乙醇）=2:38溶液。4、混合氨基酸溶液6mg/ml。5、滤纸。6、烧杯10ml（×1）。7、剪刀。8、层析缸（×2）。9、微量注射器10μl（×1）或毛细管。10、电吹风（×1）。11、722型（或7220型）分光光度计。【实验步骤】1．纸的处理取18cm长、18cm宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5cm。2．点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。3．层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。当溶剂前沿到达离上端2cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。图1滤纸的缝合4．显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图2)。图2.层析谱1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿5．计算用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。【注意事项】(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。(4)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。实验二考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度【实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595nm吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。【实验试剂与器材】1、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl稀释到2000ml。2、0.9%NaCl3、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。4、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。5、漩涡混合器6、移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），5ml（×1）7、分光光度计8、试管1.5cm×15cm(×8)9、量筒100ml(×1)10、电子分析天平11、试管架(×1)【实验步骤】一、标准曲线线的绘制取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管号试剂1234561mg/ml标准蛋白液/ml0.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.0摇匀，1小时内以1号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、未知样液的测定另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思考题】1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。（1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。（2）要求在半天内测定60个样品。（3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋白质浓度2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳【实验目的】掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。【实验原理】血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋白质。【实验试剂与器材】（一）仪器1、电泳仪；2、电泳槽；3、恒温水浴箱；4、721型分光光度计（二）材料1、人血清或鸡血清2、醋酸纤维素薄膜（三）试剂1、0.05mol/L巴比妥钠-HCL缓冲液（pH8.6）：取巴比妥钠10.3g，加蒸馏水约800ml溶解后，加入lmol/LHCL9.55ml，补加蒸馏水至1000ml，测试其pH应为8.6。2、染色液：取氨基黑10B1.0g，磺基水杨酸10g，加冰醋酸20ml，蒸馏水400ml，摇匀溶解。3、漂洗液：2.5％醋酸4、洗脱液：0.02mol/LNaOH溶液5、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸3份混合即成。【实验步骤】1．薄膜准备2．点样3．电泳4．染色和漂洗5．薄膜和透明6．定量（1）洗脱法注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。+白蛋白(A)α2βγα1%100%各管光密度读数之和该种蛋白管光密度读数）百分数（每种蛋白占总蛋白量的（2）光密度计法（3）用本法定量，正常人数值为：白蛋白54.0%~73.0%540~730g/Lα1球蛋白2.8%~5.1%28~51g/Lα2球蛋白6.3%~10.6%63~106g/Lβ球蛋白5.2%~11.0%52~110g/Lγ球蛋白12.5%~20.0%125~200g/L【注意事项】1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。2．血清或其他电泳样品应新鲜。3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。7．选择合适的缓冲液离子强度。8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。9．要控制好电流，电压和电泳时间。10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变，并应防止霉菌的滋长。11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性良好的定量结果。【思考题】1.电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。2.点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？实验四动物肝肝脏DNA的分离与鉴定【实验目的】学习常用的DNA分离方法。【实验原理】在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠(0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入EDTA(乙二胺四乙酸）。【实验试剂与器材】1．5mol/LNaCl溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至1000ml。2．0.14mol／ＬNaCl-0.15mol／ＬEDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA－Na于蒸馏水，稀释至1000ml。3．25％SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml45％乙醇。４．0.015mol/LNaCl-0.0015mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液,氯化钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水,稀释至1,000ml。5．氯仿-异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。6．1.5mol/LNaCl-0．15mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液:氯化钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水,稀释至1,000ml。7．3mol/L乙酸钠-0.001mol／ＬEDTA-Na溶液：称取乙酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水,稀释至1,000ml。8．70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。9．二苯胺试剂。10．1mol／Ｌ过氯酸溶液，将10ml过氯酸(70%)用蒸馏水稀释至11ml。11．实验材料与仪器大白鼠肝脏、匀浆器、离心机5000r/min、量筒50ml(×1)、25ml(×1)、10ml(×1)、吸管5ml(×2)、水浴锅、真空