藏红花愈伤组织诱导

藏红花愈伤组织诱导及固液两步法合成藏红花素唐芸芸生物技术2007.6.13一、论文的选题背景二、论文的研究方法三、论文后的收获四、创新和不足之处论文选题背景藏红花的生长发育期长。藏红花生长的环境条件要求苛刻。藏红花只开花不结果，繁殖困难。藏红花产量低。藏红花的生物学特性主要鉴于论文选题背景藏红花资源现状藏红花资源紧缺，在我国,藏红花只有少量分布,主要集中在西藏、浙江、江苏、上海等地，其于地方属于藏红花限制性气候因素。藏红花研究现状研究学者对藏红花的组织培养和利用藏红花愈伤组织生产次生物质研究较少。论文的研究方法试验材料及方法步骤球茎提前出芽的结果MS培养基对不同外植体愈伤组织诱导率的影响不同培养基的对同种外植体愈伤组织诱导率的影响不同的激素配比对同种外植体愈伤组织诱导率的影响。浅述了固液两步法合成藏红花素方面的问题材料与方法试验材料：外植体:叶片包括幼叶(初冬刚出苗时叶片)和老叶(初春叶片)；芽包括幼芽(球茎上的芽)和嫩芽(球茎幼芽生长约lcm左右时的芽)；球茎。材料与方法试验方法：消毒灭菌：将不同的外植体于自来水中冲洗干净，放入75%酒精中摇动30s，再以0.1%HgC12溶液中消毒8min，无菌水冲洗四次，彻底洗去残余HgC12，滤纸吸干。接种：在超净工作台上将消毒后的外植体切片(块)：叶片分叶尖、叶中部和叶基部，切约0.5cm2左右；芽分为幼芽和嫩芽，分别切成小片；球茎切成小块，分别接种。材料与方法试验方法：培养条件:诱导培养基的种类为MS,B5,White，激素浓度范围2，4-D0.1-5mg/L，BAP0.1-3.0mg/L。球茎提前出芽方法:将5～6月处于休眠时期的藏红花球茎,放置于人工气候箱中,光照强度2560lx；每天光照时间为10h；温度(20±0.3)℃；湿度为80%。每天黑暗时间为14h；温度(18±0.3)℃；湿度为80%。在此条件下培养1个月。结果与分析球茎提前出芽的结果:藏红花球茎的生长条件需要适宜的温度、湿度、光照强度。采用人工气候箱培养,上述各种指标均可人工进行调节，而且比较稳定，可以加湿并能够自动调节湿度,满足藏红花的生长需要的各种环境。试验结果表明在人工气候箱中培养藏红花比在一般培养箱中提前1个月发芽。结果与分析MS培养基对不同外植体愈伤组织诱导率的影响:由表1可见,叶片、芽和球茎均可诱导产生愈伤组织，诱导率最高达99%。不同生长时期叶片的诱导率差异明显，初冬刚出幼叶，诱导率较高，叶片老化后，诱导率明显下降，同一叶片的不同的部位(近叶尖、叶中部和叶基部)，诱导率差异不明显。幼芽、嫩芽的诱导率均高达97%，球茎的诱导率77.1%。结果与分析不同培养基种类对愈伤组织诱导率的影响:由表2可见，三种不同培养基添加一定的激素均可诱导幼叶产生愈伤组织，并且诱导率高达98%以上。培养基对藏红花愈伤组织的诱导率和愈伤组织的形态都有一定的影响。MS培养基中，愈伤组织出现的时间最早,诱导率最高,诱导的愈伤组织为大的块状,黄色或白色,生长快,又不容易褐化。White和B5培养基具有诱导率较低、部分容易褐化等缺点。结果与分析不同激素配比对愈伤组织诱导率的影响：由表3可见，不同的激素配比均可诱导幼叶产生愈伤组织，并且诱导率均在80%以上，其中当2,4-D2.0mg/L,BAP0.1-0.5mg/L时，诱导率均在95%以上，可以大量形成幼叶愈伤组织，激素配比以2,4-D2.0mg/L,BAP0.1-0.5mg/L为宜。结果与分析表1MS培养基对不同外植体愈伤组织诱导率的影响外植体接种快数出愈快数诱导率%叶片芽幼叶（初冬）老叶（初春）幼芽嫩芽球茎86010002403001500852308234292115699.131.097.597.377.1结果与分析表2不同培养基种类对愈伤组织诱导率的影响培养基接种块数出愈块数诱导率%愈伤组织的形态MS50049699.2块状;黄色或白色;生长最快,部分容易褐化White50049198.2块状;黄色或白色;生长较快,部分容易褐化B550049298.4颗粒或块状;黄色或白色;生长较快,容易褐化结果与分析表3不同培养基种类对愈伤组织诱导率的影响BAP（mg/L）2,4-D(mg/L)0.10.51.02.03.00.183.985.080.282.983.50.592.892.083.090.182.31.097.297.192.791.791.52.099.598.195.995.896.23.095.793.092.893.293.84.091.792.191.593.592.65.087.690.688.589.392.6讨论实验解决的问题：本文在藏红花的愈伤组织诱导方面，以叶片、芽、球茎作为不同外植体，分别获得了较高的诱导率。实现了不同外植体的定向培养，即在一定的条件下，使外植体向愈伤组织方向分化；在培养阶段，使用不同的培养基，根据愈伤组织的形成情况，找到了可使愈伤组织大量诱导的可行性方案；找到了合适的激素配比，我们可以通过人工改变激素的配比来控制愈伤组织的诱导率。实验得出的结论：为了获得较多的愈伤组织，选用MS培养基，以幼叶作为外植体，添加激素浓度2，4-D2.0mg/L，BAP0.1-0.5mg/L较为合适。固液两步法合成藏红花素藏红花的成分及其抗癌作用藏红花的有效成分:在藏红花的花蕊中含有的藏红花素(Crocin)、藏红花酸（Crocitin）、藏红花醛(safranal)、和藏红花苦素(Protocrocin)等有效成分，都具有较强的抗癌活性，尤其对白血病、皮肤癌、结肠癌等多数癌都具有较强的抑制作用。抗癌作用：是抑制癌细胞的DNA和RNA合成，抑制细胞蛋白激酶的活性和原癌基因的表达，抑制苯并芘等致癌物质的毒性，从分子水平抑制肿瘤的形成。半数致死量浓度很小，对正常细胞的毒副作用也小。固液两步法合成藏红花素固液两步培养法的含义固液两步培养法,既通过固体培养抑制藏红花素合成并获得较大生物量,再利用液体培养快速合成藏红花素的新型培养方法来获得大量的次生物质。固液两步法突出的优点研究得知，植物细胞在固体培养基中的增殖量经过30d可以达到5-20倍,而在液体培养基中每30d的增殖量一般为2～4倍。虽然在固体培养中细胞增殖较快,但是由于其培养基传质不良而不利于次生代谢产物合成。在藏红花细胞培养过程中,由于藏红花素合成以后会抑制DNA的合成而影响细胞分裂,所以其细胞的增殖与产物的合成相矛盾，用固液两步法完全可以解决这个矛盾。固液两步法合成藏红花素固液两步法合成藏红花素解决的问题不受气候、季节和生物的影响，细胞生长相对稳定，风险低。周期短，可以大大提高生产率，降低生产成本。可以有效解决资源紧缺、种植环境受限、繁殖周期长、价格持续暴涨、市场迟迟供不应求等问题。可以减小藏红花的进口压力，改善市场供应现状。可以迅速获得藏红花素，利于抗癌物质藏红花素的产业化生产，目前，清华大学利用液体MS培养基已成功转接藏红花愈伤组织，实现了藏红花素的大量快速生产，使藏红花的高产出现了新的曙光。论文后的收获通过查阅资料和文献，受藏红花研究者之启迪，大胆提出以下设想：如果从藏红花中分离出藏红花素，制成抗癌或预防癌症的医疗或保健药品，可以扩大其应用范围，创造更大的经济价值和社会价值。采取藏红花组织培养的方法生产藏红花素等抗癌活性物质，不但可以降低生产成本，避免自然灾害和不良环境的限制，为人类的健康作出贡献。同样是利用固液两步培养法，将培养的一定数量的愈伤组织转接到含有不同的激素配比的不同的液体培养基上，对照藏红花素的合成量，从而筛选出快速大量生产藏红花素的方法，采用合适的提取纯化方法，将藏红花素制成藏红花粉或保健品，但是此设想尚未进行试验，下一步工作有待进一步进行。论文的创新之处经过查阅植物组织培养的部分书籍、文献和资料发现，目前对藏红花的研究较少，利用藏红花愈伤组织合成藏红花素等次生物质的研究更少；而且藏红花资源较为匮乏，藏红花价格昂贵，远远超过了中等消费者的消费水平，在我国应用范围狭窄。我认为，不管从目前我国藏红花资源状况方面，还是从藏红花取得的经济效益方面，都有很大的可推广价值。论文的不足之处由于实习时间短暂，时间紧迫，加之试验周期较长，故试验重复次数较少，只是做了试验的一部分，还有部分试验未动手操作。因为时间的关系，本次论文正交试验设计不完全，只对一种外植体作了介绍，其他的试验处理未进行试验，也未作详细介绍。