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流式细胞术一、流式细胞术的介绍二、流式细胞仪的结构和使用三、流式细胞专用术语与概念四、Guava流式细胞仪应用举例流式细胞术简介•流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行定量分析和分选的检测手段，以激光为光源对细胞的散射光和荧光的一系列光学信号进行分析。•研究对象为生物颗粒,如各种细胞。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并可加以定量。流式细胞仪基本构造样品被激发光照射后，产生的荧光信号被光电倍增管接受，它们再把光信号转换陈电脉冲信号。电脉冲强度则反映了荧光强度，二者呈正比。液流系统流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。光学系统•经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。激光器以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。•光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。•光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。•一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。•另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。电子器件计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。流式细胞分析的几个基本概念•Lightscatterintensity散射FSCSSC•SideScatter–侧向散射角的工作原理：细胞表面越粗糙，内部颗粒越多，SSC越大•在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0。角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90。角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。•Fluorescenceintensity:FL荧光强度MFI:MeanFluorescenceIntensity平均荧光强度Threshold：阈值设定•阈值:任何在此参数之下的细胞/颗粒的荧光信号都不会被获取或记录。•阈值设定:获取目标细胞群的参数，排除目标细胞之外的信号。•设定范围：一般对前向角散射光(FSC)设定阀值，来排除杂质或细胞碎片或体积变小的死细胞。Threshold的应用Guava流式细胞仪NexinViaCountCaspaseCellgrouthCelltoxocityTunelCellcycleExpressPro特点细胞分析仪的检测过程Guava流式细胞仪制样•合适的细胞浓度:350-500cells/μl，细胞浓度过大，会造成细胞之间距离太近，两个或多个细胞粘在一起，但他们通过分析点时，很难分辨更多的信号也不至于堵塞毛细管，而中断工作。•适当的流速：verylow,low,median,high•样品的大小：如果细胞太小，则无法与噪音分开；样品太大，如组织块，则要提前过滤膜。•常见荧光素!!数据报告:直方图和散点图直方图：单个参数X-轴:FL信号Y-轴:细胞数散点图：两个参数X－轴和Y－轴表示2种荧光大小,每个点表示一个细胞Log&LinGuava8HT的应用举例之一•凋亡检测ApoptosisGuavaNexin®AssayNexin一般结果应用领域作业简述流式细胞仪的原理和使用