流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪分析技术及应用•流式细胞术主要包括：•1、液流技术•2、细胞的分选和计数技术•3、数据的采集和分析技术流式细胞术发展史•主要特点：•单个细胞水平分析；•多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；•高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；•可分析大量细胞；•速度快：5000-10000个细胞/秒；•统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；•分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。流式细胞仪分为三大类：•一类为台式机（临床型）：•BDFACSCalibur流式细胞仪特点：•仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。•两激光配置：488nm633nm•检测参数：四荧光参数两个散射光参数•分析型流式细胞仪•应用：细胞分析检测FCM图片——台式机•第二类为大型机（科研型）•特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。FCM图片——大型机•第三类为新型流式细胞仪：•随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。BDFACSAria流式细胞仪：•高速分析分选流式细胞仪•高速分析•高速分选•3根激光：488nm•633nm•375nm结合特制高性能石英杯流动室•应用：细胞分析分选•sp细胞检测•一般分为5部分：•①流动室及液流驱动系统；•②激光光源及光束成形系统；•③光学系统；•④信号检测、存贮、显示、分析系统；•⑤细胞分选系统。流式细胞仪构造模式图•光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。•光学测量台：完成光学信号测量和转换•电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。•由样本和鞘液组成•待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流•鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室与液流驱动系统•细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli方程：•P=(1/2)PV（勿略高度的变化）•真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一个恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。•改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。•激光光源：采用气冷式氩离子激光器•分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长•光束成形器：两十字交叉放置的透镜•透镜组：形成平行光，除去室内光•滤片：长通、短通、带通•光电倍增管（PMT）：FSC,SSC（散射光），•FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）流式细胞仪构造模式图激光光源与光束成形系统•大多采用氩离子气体激光器：•激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。•激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。•这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。•激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。激光光源及光束成形系统•主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：•1、长通滤片：（long-passfilter,LP）：LP500滤片允许500μm以上光通过，而500μm以下光吸收或返回。•2、短通滤片（short-passfiltr,SP）：与长通滤片相反，如SP500滤片允许500μm以下光通过，500μm以上光吸收或返回。•3、带通滤片（band-passfilter,BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。•如BP500表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。长通滤片短通滤片带通滤片主要由计算机及其软件分析系统组成散射光信号示意图前向散射光（forwardscatter,FSC）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。•当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：•一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；•另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于90o方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。•通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。•荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同，可以显示不同的荧光颜色如红色、绿色、蓝色等。•每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管（PMT）。•一般有两类放大器：线性放大器和对数放大器荧光染料的特性•常配置的激光器波长为488nm•通常采用染料：•碘化丙锭(propidiumiodide，PI)、PI630nm•藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、PE575nm•异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）FITC525nm•PE-CY5等。•633nm激光器常用染料有•APC•APC-Cy�•激发波长发射波长•FITC488nm525nm•PE488nm575nm•PE-TR488nm615nm•PE-Cy5.5488nm667nm•PE-Cy7488nm767nm•（以上五种荧光染料可在CoulterXL或BDCalibur或Partec,PAS,Cyflow，Cytomation,Moflo机型上使用）•APC633nm660nm•APC-Cy633nm767nm•(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用）荧光信号示意图以激发光光源波长488nm为例示意图：•①荧光信号的线性测量与对数测量：•主要由电子线路来完成•当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT），PMT将光信号转换成电信号。•电信号输入到放大器放大，放大器分两类：•线性放大和对数放大•线性放大器：即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。•②荧光信号的面积和宽度•所谓荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。•荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2M期细胞相等，这样得到的测量数据G2M期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。•③光谱重叠的校正•当细胞携带两种荧光素（如PE和FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。•要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。•各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC，PE的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC受激后多数将光源转变为525nm左右的光；PE多数将其转变为575nm左右的光。•同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。•分选收集装置：•微管12×75mm15ml管•微孔板分选•可以用24/96/384/1500微孔板进行微孔分选。•检测指标：•阳性百分率•绝对计数•平均荧光强度•分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。•分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。•分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。•分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。•参数：FSC,SSC,FL•数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种数据显示方式：•单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图•设门分析技术•目前FCM数据存贮的方式：采用列表排队（listmode）方式•目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用listmode方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4个参数，那么获取10000个细胞，所占容量为4×10000个（字或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3个参数，节省3/4的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。FSC：反映颗粒的大小SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少•单参数直方图•双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图•三参数直方图•多参数分析由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。•如图表示细胞DNA单参数直方图，横坐标表示荧光信号强度，纵坐标代表所检测的细胞数。直方图•直方图(DistributionHistogram)–横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。–纵坐标一般是细胞数。•双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。•双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。•在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2中二个参数作为X轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；•X坐标为该细胞一参数的相对含量•Y坐标为该细胞另一参数的含量。•在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，