第二十一章 免疫学方法技术

第21章免疫学方法技术第一节基于Ag-Ab反应的检测方法抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serologicalreaction)用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性抗原抗体反应的特点应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体—诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂沉淀反应补体参与反应中和反应2341免疫标记凝集反应2435Ag-Ab反应的基本类型一、凝集反应（agglutinationreaction）概念：细菌、细胞等颗粒性抗原或包被有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯乳胶等）与相应的抗体结合，出现肉眼可见的凝集团，称为凝集反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。细菌的鉴定和血型的检查检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体二、沉淀反应（precipitation）概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。在液体中进行出现絮状沉淀，在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。1．单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)2．双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)3．免疫电泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比浊(immunonephelometry)1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。环的直径与抗原含量成正相关2、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。1）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，2）对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术3）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。4、免疫比浊在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。三、补体参与的反应溶菌反应细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解。主要发生于霍乱弧菌等G+菌，可用于细菌鉴定。溶血反应红细胞与相应抗体结合，通过激活补体使红细胞溶解，可作为补体结合试验的指示系统。补体结合反应是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验。第二节免疫标记技术免疫标记技术（Immunolabellingtechnique）概念：用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质未改变抗原抗体的免疫学特性，同时标记物极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）一、免疫荧光法(immunofluorescence,IF)概念：荧光素标记的抗体（抗原）与组织或细胞中的相应抗原（抗体）结合，借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原（抗体）进行鉴定或定位。（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法图示MousekidneysectionLaminin-green-fluorescentQdot®565IgGCD31-red-fluorescentQdot®655IgGNuclei-blue-fluorescentHoechst33342ControlTSLPTSLP-AlexaFluor®488Nuclei-propidiumiodideHASMC流式细胞术（FlowCytometry,FCM)概念：FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞仪的细胞分析原理待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，实现了细胞的定量分析。再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。流式细胞仪工作原理二、酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。常用的酶为：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP）酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺（OPD）3、3‘二氨基联苯胺（DAB）氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验̶测定可溶性抗原或抗体（2）免疫细胞或组织化学̶测定组织中或细胞表面的抗原1.免疫细胞或免疫组化技术概念：应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。ICCIHC2.酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体（聚苯乙烯微量反应板）上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。ELISA试剂盒1.双抗体夹心法用于检测特异性抗原。方法：将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。2.间接法用于检测特异性抗体。方法：将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。抗原一抗二抗生物素HRP亲合素＋3.竞争法用于抗原和半抗原（抗原决定簇少）的定量测定，也可用于测定抗体。方法：以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。ELISA反应过程动画演示A.用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞B.用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子4.酶联免疫斑点试验三、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)概念：是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。结合相游离相基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性示意图RIA法原理及标准曲线7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）四、化学发光免疫分析概念：将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。灵敏，无污染，可用于替代放射免疫。五、免疫胶体金标记技术(immunogoldlabelingtechnique)概念：是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。电镜：高电子密度试纸：胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，具有高电子密度，在电镜中颗粒致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。胶体金标记举例：胶体金试纸检测尿HCG早孕尿试纸条：两条杠，检测迅速，灵敏度高1）干燥试纸条胶体金免疫快速检测HCG原理2）加样1.双抗体夹心法-大分子抗原3）反应和迁徙4）阳性结果：两条红线5）阴性结果：一条红线胶体金免疫试纸构造六、免疫印迹技术免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Westernblotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。凝胶电泳和固相免疫测定技术将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。Westernblotmethod包括5个步骤：1)固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。第三节检测淋巴细胞及其功能的体外试验单个核细胞的分离淋巴细胞