第七章 双水相

第七章双水相萃取技术溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。聚合物的不相溶性：主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系①系统含水量多达75%～90%,两相界面张力极低,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递②分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有5～15min。③双水相萃取技术易于连续化操作。④目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。(P141)⑤大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2个分离步骤,使整个分离过程更经济。⑥设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。双水相萃取技术的优点一、双水相分离理论1、双水相的形成熵增——混合——自发分子间作用力------随着Mr的增加,而增大.聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发生分相的现象.常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－无机盐系统无毒原则2、相图临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如C点。均相区两相区双节线系线聚合物的分子量越高，相分离所需的浓度越低两种聚合物的分子量相差越大，双节线的形状越不对称。3、物质在两相中的分配和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。CTK=——CBCt、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大)2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大)3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数(1)聚合物的影响；(2)体系中无机盐离子的影响；(3)体系pH的影响；(4)体系温度的影响；(5)体系中微生物的影响。1）表面自由能的影响λ=γp2－γp12）表面电荷的影响道南电位(,Donnanpotential):实际双水相系统中有电解质,当这些离子在两相中K1,则两相间产生电位差U2，U1——相1和相2的电位Z+,Z－——分别表示一种盐的正负离子的离子价F——法拉第常数T——温度进一步可证明：InKi*=InKi+ZiF(U2-U1)RTKi*——i组分带电时在体系中的分配系数Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数Zi——i组分的离子价意义：A荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比.B由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的不同,故k与Zi的关系因盐而异。3）综合考虑4）影响分配平衡的参数(1)聚合物的影响A聚和物的分子量的影响当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如在PEG—DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。(P135)B成相聚和物浓度的影响当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于1。如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减小低于1。(2)体系中无机盐离子的影响盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说,盐的存在就会使系统的电荷状态改变,从而对分配产生显著影响。（P137）盐的种类对双水相萃取也有一定的影响,因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性。在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在PEG/磷酸盐/水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由4提高到120,而在PEG/DeX/水体系中只从1.55提高到5。(3)体系pH的影响pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。交错分配法(crosspartitioning):当加入不同种类的盐时，由于相间电位不同，lnk–pH关系曲线也不一样。但在pI处，k应相同，即两条关系曲线交于一点。所以,通过测定不同盐类存在下lnk–pH曲线的交点,可测定蛋白质/细胞器以及微粒的pI。血清蛋白(4)体系温度的影响一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界点时，影响较小。大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;(2)常温下溶液粘度较低,容易相分离;(3)常温操作节省冷却费用。(5)体系中微生物的影响结合P139图7-10和P140图7-11二、双水相萃取技术的应用1.双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制目前已知的胞内酶约2600种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步是将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；②酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；③两相用离心机很容易分离。工程方面的问题在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且能耗也很少。两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采用自动排渣的喷嘴分离机。PEG:主体回收利用，盐相中少量残余超滤或透析除去。PEG/盐更适合用重力沉降；PEG/DeX多用离心机。在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。2.两水相反应器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionsubstrateproductenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionwithATPS要进行两水相生物转化反应满足下列条件：①催化剂应单侧分配；②底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此常需要根据试验选择最优系统和操作条件。采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：①消除产物抑制，产率高②与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；③生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在10μm以下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。三、双水相萃取技术的发展1.PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团；2.采用多级萃取。作业：第七章双水相萃取1.普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是：(1);(2)2.生物工程中常用的双水相体系主要有：，等体系。3.在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）双水相体系中分配的因素有哪些?分配系数K分别怎样变化?4.请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。