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鸡胚成纤维细胞的培养切取意欲培养的动物器官或组织剔除多余成分洗去血污将所取组织剪碎胰酶消化机械方法吹打组织块反复冲洗除去胰酶静置加入培养液重悬成细胞悬液计数细胞培养原代培养的基本实验流程:[目的要求]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。[实验材料]9～10日龄鸡胚，PBS液50mL，0.25％胰蛋白酶5mL、DMEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，滴管若干，细胞瓶，蛋座，75％酒精，水浴锅。[实验内容及操作程序]1.取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用PBS液(简称P液)洗去体表血液，移入另一灭菌平皿中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加3mLP液轻摇，后将P液与组织碎块一起用滴管移入细胞瓶中。2．消化从水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入细胞瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，细胞瓶上加塞，以免污染。37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。3．洗涤往细胞瓶中加入3mLPBS(目的是稀释胰酶浓度终止胰酶的消化),充分混匀后静置1min，让组织块下沉后，吸去上层胰酶液(千万小心不要吸掉下层组织块)------就是放多少胰酶液就吸多少出来，用PBS液共反复洗3次，以洗去胰酶。4．吹打最后一次吸去胰酶后,加2mL含5％小牛血清DMEM培养液于细胞瓶中，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。将细胞悬液静置一分钟，以使未冲散的细胞块下沉，然后小心的吸取0.2-0.2mL的悬液放入准备好的细胞瓶中，细胞瓶内吸入4mL的5%小牛血清DMEM，计数。注：本实验过程中，在前一步吸取DMEM时，宜同时将4mL培养液分装到细胞瓶。5．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数注意事项1、务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充分混匀细胞悬液。2、对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计数6．分装到细胞瓶后放入37℃中进行培养.防止污染是决定细胞培养是否成功的首要条件:1.在实验前,操作室,无菌工作台等实验场所需用紫外灯消毒30分钟.2.实验前先洗手,并用75%的酒精消毒手及放入无菌台的器具.3.在进入无菌台后,先点燃酒精灯.吸管在吸液体前,瓶口在打开和关闭前都应在火焰上旋转灭菌,以免附在瓶口的细菌污染液体.烧过的金属器械要待冷后才能接触组织,以免造成组织损伤.4.进行细胞培养时,操作动作要准确,敏捷,但不必太快,以免引起空气流动过大,增加污染机会.为拿取方便,工作台面上的用品要合理摆放.液体在未用前不要过早打开瓶盖,用后应及时封闭瓶口.操作时不要向着无菌台讲话或咳嗽,以免把口腔中的微生物带入工作台而发生污染.1、用镊子敲碎气室的蛋壳部，掀开各层膜，取出胚体。2、放进平皿中，去头，去肢，去内脏，用PBS洗涤。3、洗好的组织放进另外一半平皿，加一管PBS，一起剪碎组织。4、静置一段时间，吸出一部分清液，将组织和少量的清液一起移入细胞瓶。5、吸取胰酶到细胞瓶中，放入水浴锅消化，5min摇动一次，到液体混浊，20-30分钟。6、加入两管PBS，吹打，静置1min，吸出上层的清液，再加入PBS,重复1-2次。7、加两管培养基到另外一个细胞瓶中，盖好盖子备用。（旧瓶）加一管培养基，吹打，静置少许时间，吸取适量的悬液（此时是细胞悬液），放入加好了培养基的新瓶中，稍微吹散。8、放入37℃温箱培养。