鸡胚细胞的原代培养

鸡胚细胞的原代培养摘自《细胞培养基本知识》-Invitrogen细胞培养的用途照片来自《动物细胞培养-基本技术指南》提纲1.培养基的类型及配制2.原代培养的过程3.原代培养的注意事项4.本次实验操作要点5.实践操作培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。不同的细胞系所需要的培养基是不同的。（一）天然培养基：类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：1.来源受限。2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。3.易发生支原体污染（二）合成培养基概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分:氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点:缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血清)。血清的成分血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有以下成分：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟。血清的消毒：过滤除菌。实验的可重复性？？1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。无血清培养基无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司CHO无血清培养基：维森特公司树突状细胞无血清培养基：达优公司抗菌素的使用抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。培养基的配制RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位/毫升加三蒸水至1000ml,调节pH值至7.2，过滤除菌。加无菌血清至终浓度为10％。照片来自《动物细胞培养-基本技术指南》本次实验内容原代培养的过程取材——培养材料的制备——接种——加培养液—培养上次实验部分器材：5ml枪头15支、培养瓶4只、10ml烧杯1只、25ml烧杯1只、25ml三角瓶1只、培养皿1套、中号镊子1只、小镊子1只、胶塞4+1只、剪刀1把、饭盒1个、脱脂棉少许、裁纸刀1把、纱布1块、2ml管2个、1.5ml管3个包装：中镊/小镊/剪刀1套烧杯大１（塞纱布），小1胶塞2＋１个（2小/1大）培养皿1套／包锥瓶１个封口培养瓶封口1份1个1份3个/包枪头塞好棉花单独包，然后30支一大包2ml、1.5mlEP管1份1个，写好标记标记：饭盒、瓶大小包、组号、姓名（1组2人）饭盒1.超净工作台内：污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、蛋座培养瓶装1瓶：有1640完全培养基（方瓶，淡红色；含血清）；Hank’s液（圆瓶，无色）；饭盒1只（内有胶塞、剪刀、镊子、培养皿、烧杯、培养瓶等）；胰酶1管（1ml,EP管内；标有E）；灭菌枪头4-5支；2.塑料篮子内：无菌袖套操作1.照egg,画气室线。2.戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。3.台面消毒;4.将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。5.中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。6.小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。标记气室示意图操作•照egg,画气室线。•戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。•台面消毒;•将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。•中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。•小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用Hank’s液清洗。含鸡胚鸡蛋示意图照片来自《动物细胞培养-基本技术指南》6.将鸡胚转入培养皿B再次清洗（培养皿B装有Hank’s液）;7.培养皿A换Hank’s，材料再于培养皿A中漂洗;8.剪取适当的组织块,转入小烧杯(10ml)，剪成0.5~1mm3碎块(保持湿润）。9.将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯,合入锥瓶,迅速摇匀;10.锥瓶加塞,用锡箔纸覆口,拿出工作台,于37℃水浴锅中消化5~7分钟(严格，6分钟)!,中间摇动2~3次;11.加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹打7~8次（请减少气泡产生）;12.将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!)用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;13.分别取2ml和3ml细胞悬液分别接种至两只培养皿和两只培养瓶中,分别补加培养液至总体积3.5ml（培养皿）和5ml（培养瓶）;14.培养瓶加塞,侧面标记。37℃培养.15.星期五下午6：00来进行细胞传代和冻存的实验。生长面照片来自《动物细胞培养-基本技术指南》照片来自《动物细胞培养-基本技术指南》肺肝腿部肌肉肾脏摘自《细胞培养基本知识》-Invitrogen注意清理台面,用品洗净,交回。酒精灯和酒精棉球瓶要补加酒精。实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验一起写一份细胞报告。重点：要对实验结果进行分析和讨论。实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩考核内容。无菌实验操作记入实验考核。